| 研究課題/領域番号 |
26288077
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| 研究機関 | 北陸先端科学技術大学院大学 |
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研究代表者 |
藤本 健造 北陸先端科学技術大学院大学, マテリアルサイエンス研究科, 教授 (90293894)
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| 研究分担者 |
坂本 隆 北陸先端科学技術大学院大学, マテリアルサイエンス研究科, 助教 (80423078)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 光クロスリンク / 19F NMR |
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| 研究実績の概要 |
信号が尖鋭な19F NMRのケミカルシフト変化による核酸検出法は、生体バックグラウンドが皆無で、信号の生体組織透過性が高いことから、in vivoなど夾雑試料中での核酸検出法として注目されている。しかし既存の核酸研修プローブではケミカルシフトの変化幅が小さく（0.5 ppm程度）、B/F分離が困難であった。そこで、超高速DNA光クロスリンク反応による２重鎖形成依存的な化学構造の変化に着目した。配列依存的な光反応に伴う反応部位の炭素の電子軌道の変化（Sp2→Sp3）により、既存のプローブよりも大きなケミカルシフト変化が期待できる。そこで、本基盤研究ではこの原理による核酸検出プローブの開発を目的としている。既に平成２６年度において５トリフルオロチミジンを標的架橋ピリミジンとして用い実際に366 nmの光照射を行ったところ、光架橋により8 ppmのケミカルシフト変化が見られ、既存の核酸検出プローブの約１６倍のケミカルシフト変化を示すことを見出している。平成２７年度はこの8 ppmのケミカルシフト変化を誘起できる光クロスリンクを用いて実際にnMオーダーの低濃度マイクロRNAを夾雑物の中から検出できるか検討を行った。DNA光架橋反応を組み込んだハイブリダイゼーション連鎖反応（pHCR）による標的遺伝子検出を行い、モデルRNAに対する増幅効果を検証した結果、光照射により１,０００倍程度の信号増幅が達成され、nMオーダーのマイクロRNAの選択的検出が可能であることを実証した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成２６年度の本基盤研究に関わる実績報告書内の今後の研究推進方策において「8 ppmのケミカルシフト誘起可能なシステムを実際にnMオーダーの少量マイクロRNA解析検出可能か検証する」としていた。
本年度はこの研究推進方策に忠実に従い実際にnMオーダーの低濃度マイクロRNAを夾雑物の中から検出できるか検討を行った結果、DNA光架橋反応を組み込んだハイブリダイゼーション連鎖反応（pHCR）による標的遺伝子検出を行いることで、モデルRNAに対する増幅効果光照射により１,０００倍程度の信号増幅が達成され、nMオーダーのマイクロRNAの選択的検出が可能であることを実証した。以上のことから計画通りに進展していると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成２７年度の成果より、nMオーダーの少量RNAを増幅しながら19FNMRを用いてシグナル解析可能であることを見出している。そこで、本手法による細胞内RNA検出の可能性を探るため、ヒト細胞内で比較的細胞内の存在量の多い、28S rRNAを標的とするプローブを合成する。報告されている28S rRNA用の蛍光プローブ（Abe H. et al., PNAS, 2006）を参考に配列設計を行う。標的配列をもつ合成オリゴRNAを用いてプローブの機能評価（19F NMRによる標的RNA検出能力）を行った後、パラホルムアルデヒド等で固定したヒト白血球細胞（HL60）の懸濁液に添加・光照射後、19F NMR測定を行い、そのケミカルシフト変化から、細胞内RNA検出能力を評価する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初、nMオーダーのマイクロRNA検出に向けて増幅系の構築の際の条件設定が困難ではと考えていた。HCR法（ハイブリダイゼーション増幅法）において考えられる変数（使用するオリゴ核酸の配列、長さ、用いる酵素）の最適化のために物品費等を計上していたが、結果的に最適化が初期条件近くで設定できたため、使用金額が当初予定より少なくなった。またnMオーダーの核酸類の検出について論文化を行っていたタイミングもあり、この実験に関連する成果発表を見送った。
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| 次年度使用額の使用計画 |
最終年度は実際の細胞を用いて実験を行う予定であり、細胞培養に関わる物品費を計上し、またnMオーダーの核酸類の検出について論文化も行ったので、国内外で成果発表を行いたいと考えている。
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