研究課題
3本鎖DNA結合蛋白質のN末端領域が、3本鎖DNAとの結合に必要な3本鎖DNA結合ドメイン(TBD)であることを、筆者は既に明らかにしている。本年度は、1本鎖DNAが分子内で折り畳まって形成される分子内3本鎖DNAとTBDの複合体の高次構造や、分子内3本鎖DNAとの結合に伴うTBDの構造変化の可能性を検討するために、分子内3本鎖DNAとTBDの複合体を超遠心分析で解析した。超遠心分析から求められる、球状蛋白質の摩擦比は通常1.1-1.3程度である。しかし、TBD単独の場合や分子内3本鎖DNA単独の場合の摩擦比はいずれも1.8-2.0と大きな値を示し、TBDも分子内3本鎖DNAも非常に細長い形状であると考えられる。一方、TBDと分子内3本鎖DNAの複合体の摩擦比は1.4-1.5程度であり、TBD単独や分子内3本鎖DNA単独の場合と比べて、摩擦比が小さくなり、球状に近い構造になったと考えられる。つまり、天然変性状態であるTBD が分子内3本鎖DNAに結合する際に、折り畳まった構造に変化したためであると考えられる。一方、標的遺伝子の上流に形成された分子内3本鎖DNAが転写活性に及ぼす影響を、T7RNAポリメラーゼによるin vitro転写系で解析した。T7プロモーター配列の下流に、分子内3本鎖DNA形成配列を挿入したDNAを鋳型として、T7RNAポリメラーゼによる転写反応を行ない、転写産物であるRNAを解析した。また、標的遺伝子の上流に挿入した分子内3本鎖DNAの熱安定性をUV meltingで解析し、3本鎖DNA形成用1本鎖DNA (TFO)が標的2本鎖DNAから解離する融解温度Tmを解析し、分子内3本鎖DNAの安定性を評価した。分子内3本鎖DNAの安定性が高い場合に、T7RNAポリメラーゼによる転写活性が効率的に抑制され、短い転写産物が大量に観察された。安定性の高い分子内3本鎖DNAのほうが転写活性を効果的に抑制すると考えられる。
2: おおむね順調に進展している
平成27年度の研究目的である、3本鎖DNA結合蛋白質と3本鎖DNAの複合体の高次構造に関する情報を解明することができたから。また、平成27年度のもう一つの研究目的である、3本鎖DNA結合蛋白質や3本鎖DNA形成が転写活性に及ぼす影響を解明することができたから。
緩衝液のpHやイオン強度や温度を変化させて、3本鎖DNA結合蛋白質と標的3本鎖DNAの結合をゲルシフト法や等温滴定型熱量計や生体分子間相互作用解析装置で解析する。これより、3本鎖DNA結合蛋白質が標的3本鎖DNAを認識する結合の熱力学的・速度論的特性を解明し、2本鎖DNA結合蛋白質が2本鎖DNAを認識する結合の熱力学的・速度論的特性と比較する。平成26年度と平成27年度の知見と合わせて、3本鎖DNA結合蛋白質が3本鎖DNAを特異的に認識する立体構造的基盤を解明する。3本鎖DNA結合蛋白質発現用プラスミドと3本鎖DNA形成用1本鎖DNA (TFO)を同時に培養細胞に導入し、3本鎖DNA結合蛋白質存在下のほうが、培養細胞内で標的遺伝子の発現を効率的に制御できるかを検討する。平成26年度と平成27年度の知見と合わせて、3本鎖DNA結合蛋白質を3本鎖DNA形成時に共存させることで、生理的条件での3本鎖DNA形成を促進し、3本鎖DNA結合蛋白質を活用した、新規の人工的遺伝子発現制御法を開発する。
消耗品の使用額が予想よりも少なくて済んだため。
平成28年度分として請求した助成金と合わせて、効率的に使用する。
すべて 2016 2015
すべて 雑誌論文 (2件) (うち国際共著 1件、 査読あり 2件、 謝辞記載あり 2件) 学会発表 (6件) (うち国際学会 1件)
Chem. Commun.
巻: 52 ページ: 2354-2357
10.1039/c5cc08300a
巻: 51 ページ: 17343-17360
10.1039/c5cc02693h
