| 研究課題/領域番号 |
26289314
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
舟橋 久景 広島大学, サステナブル・ディベロップメント実践研究センター, 特任講師 (60552429)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | ホモジニアスアッセイ / バイオセンサー / 分割核酸酵素 / DNAナノピンセット構造 |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題は、申請者が開発しているDNA ナノピンセット構造体（DNA-NT）蛍光バイオセンサ作製技術を基盤にして、（重点課題1）DNA-NTへの機能ドメイン修飾技術、（重点課題2）標的を任意タンパク質分子などへ拡張する技術、（重点課題3）酵素活性としてシグナルを出力させる技術、を開発することによって、洗浄操作の必要ないホモジニアスアッセイによって任意の核酸やタンパク質を自在に検出するための核酸構造体センシング分子作製法を確立することを目的としている。
H27年度は以下の課題を中心に研究を推進した。
（重点課題1）生肝臓細胞内へグルコーストランスポーター１（GLUT 1） mRNA測定用DNA-NT蛍光バイオセンサを導入し、生細胞内のGLUT 1 mRNA のホモジニアスアッセイを実現した。さらに、インスリン刺激に対する生肝臓細胞遺伝子発現応答の連続モニタリングに成功した。
（重点課題2）前年度に作製した分割G-quadruplex再構成誘導型DNA-NTを利用し、ランダムDNA-NTの中から、標的タンパク質を認識するDNA-NTをスクリーニングにより獲得する原理の実証を行った。標的分子として、前年度に利用したHes1 mRNAのモデルssDNAを利用した。その結果、モデルssDNA添加時においてのみHes-1 mRNA測定用DNA-NTがヘミンカラムに結合し、他の競合DNA-NTと比べて優先的に回収されることを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
（重点課題1）標的mRNA測定用DNA-NT 蛍光バイオセンサを生細胞内へ導入し、生細胞内標的mRNAのホモジニアスアッセイを実現した。さらに、本アッセイ法を用いることにより、外部刺激に対する生細胞の遺伝子発現応答を連続的にモニタリングすることが可能であることを示した。
（重点課題2）標的認識部位にランダム配列を有するランダムDNA-NTの中から、標的タンパク質を認識するDNA-NTをスクリーニングにより獲得可能であるという、標的を任意タンパク質分子などへ拡張する技術の原理実証に成功した。H28年度では実際のバイオマーカーなどを認識するDNA-NTの開発が期待される。
（重点課題3）H26年度に標的mRNAを検出するとペルオキシダーゼ活性を生じる分割G-quadruplex再構成誘導型DNA-NTに成功した。
以上の理由から本研究課題が順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
（重点課題1）DNA-NTへの機能ドメイン修飾技術；ビオチンを介した機能修飾法、チオール基導入による機能修飾法、相補的な核酸配列をタグとして利用する機能修飾法を検討する。重点課題3とリンクし、標的核酸の簡便な検出法開発を行う。各種修飾法を用いてビーズや電極などへ固定化した状態におけるDNA-NTの機能を検討する。また細胞内局在化ドメインの修飾による、局所的な細胞内アッセイ法開発への展開が期待される。
（重点課題2）標的を任意タンパク質分子などへ拡張する技術；標的認識部位にランダム配列を持つ分割G-quadruplex再構成誘導型DNA-NTライブラリーを作製し、その中から目的の標的を認識するDNA-NTを取得するためのスクリーニング法を開発する。具体的な標的として、腎疾患のタンパク質バイオマーカーであるLiver-type Faty Acid-Binding Protein（L-FABP）を選定し、これを検出するためのDNA-NTの開発を目指す。
（重点課題3）酵素活性としてシグナルを出力させる技術；すでに標的認識に伴うDNA-NT の構造変化を利用して、分割G-quadruplex酵素の再構成を誘導する、分割G-quadruplex再構成誘導型DNA-NTを開発した。G-quadruplexはペルオキシダーゼ活性を示す核酸酵素である。本年度は、重点課題1、2と連携し、このDNA-NTを用いたマイクロRNAやウィルスRNA、バイオマーカーなどを簡便に検出する、Point of care testing (POCT)に向けた簡易検出プラットフォーム開発を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
H27年度には、標的認識部位にランダム配列を有するランダムDNA-NTの中から、標的タンパク質を認識するDNA-NTをスクリーニングにより獲得可能であるという、標的を任意タンパク質分子などへ拡張する技術の原理実証に成功した。しかし、実際のバイオマーカーなどを認識するDNA-NTの開発には至らなかった。当該費用は、バイオマーカー認識用DNA-NTの開発・解析費用として利用を計画していたものであることから、次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
H28年度は、具体的な標的として腎疾患のタンパク質バイオマーカーであるLiver-type Faty Acid-Binding Protein（L-FABP）を選定し、これを検出するためのDNA-NTの開発を目指す。
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