| 研究課題/領域番号 |
26289317
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| 研究機関 | 兵庫県立大学 |
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研究代表者 |
根来 誠司 兵庫県立大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (90156159)
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| 研究分担者 |
武尾 正弘 兵庫県立大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (40236443)
加藤 太一郎 鹿児島大学, 理学部, 助教 (60423901)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | バイオコンバージョン / タンパク質安定化 / ナイロン / 分子動力学 / 耐熱化機構 / サブユニット間相互作用 |
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| 研究実績の概要 |
バイオコンバージョンを用いた合成ポリマーの再資源化を実現するためには、分解に関与する酵素の高機能化と安定化が重要である。ナイロン再資源化に重要なナイロン分解酵素NylCについて、立体構造解析から、耐熱化に有望な候補箇所を選出し、部位特異的変異導入を行った。モノマーA/D界面の変異（D36A、D122G、H130Y）、およびA/B界面の変異(E263Q）を、野生型NylC (Tm = 52℃)に導入すると、得られた４置換体では熱安定性は36℃上昇する (Tm = 88℃)。しかし、 同変異体を親型酵素として、新たにランダム変異を導入すると、殆どの変異体で熱安定性が低下するか、或いは、細胞内発現が見られなくなった。RT-PCRによる遺伝子発現量算出から、mRNAの合成は正常に行われていると判断した。NylCポリクローナル抗体を用いて免疫分析を行ったところ、①可溶画分に活性型として存在、②可溶画分に前駆体型として存在、③沈殿画分に前駆体型として存在、④可溶画分にフラグメントのみが存在の４種類の挙動を取ることが分かった。状態②および③は、何れも自己分断能を失ったためであり、状態③では、さらに、モノマー間の不適切な会合により、不溶性凝集体を形成したためと考えられる。また、状態④では、発現段階で不安定化したため、細胞内プロテアーゼによる分解を受け、フラグメント化したものと推測した。NylC変異体の挙動をMDシミュレーションにて解析を行うと、122位変異体のサブユニット間距離が、Tm値の上昇に伴い近接する現象が見られた。また、フラグメントのみが存在していたGYAQ-Q299D変異体では、残基間距離の経時変化において、不規則なパルスが多数存在していた。各種変異体の溶液状態での挙動、および、アミノ酸置換の熱安定性に及ぼす効果を、免疫分析と計算科学による解析結果を合わせて考察した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
合成ポリマーの生物変換については、これまで研究例が少ないが、我々は、酵素生化学とＸ線結晶構造解析に基づいて、酵素機能と構造との関連性を解析し、得られた知見から、タンパク質工学的手法を活用して、酵素の構造と、触媒機能・安定性との関連性について系統的な検討を行った。本年度は、１．90℃以上の耐熱化酵素を取得できたこと、２．本酵素が５０％エチレングリコールを含有する水溶液中で活性を保持することが確認できたこと、３．６-アミノヘキサン酸以降の代謝酵素経路についても、その実証に成功したことから、生体触媒を用いたナイロンの再資源化の可能性を示すことができたと思われる。さらに、得られた研究成果は、生化学分野の国際論文誌に掲載され、本研究の独自性は高いと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
生化学的な実験（酵素活性測定、溶液状態の解析）、結晶構造解析、及びMDシミュレーションなど中心として、酵素の耐熱化機構を明らかにする。前年度までの研究から、EG濃度の増加に伴い、立体構造の中でαヘリックスが増加することが推定できること、50％EGを含む溶液中で、耐熱化酵素を95℃まで加熱した後、25℃に戻した状態でCD測定を行ったところ、加熱を行わなかった場合に近いスペクトルが得られたことからEG中で構造がリフォールディングする可能性が示唆された。この結果は、ＥＧ中で、一旦、酵素の構造が変性しても、リフォールディングにより、再生し、酵素反応に再利用可能である可能性を示す興味深い現象である。従って、今後、ＣＤスペクトル分析と蛍光分析を中心に、この現象についての解析を試みる。さらに、モノマーからのバイオコンバージョンについても、初発段階の代謝酵素を解明することができたことから、非天然アミノ酸の生物変換分野へ産業応用の可能性についても検討する。
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