| 研究課題/領域番号 |
26290002
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| 研究機関 | 群馬大学 |
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研究代表者 |
柳川 右千夫 群馬大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90202366)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | GABA / GAD65 / GAD67 / ノックアウトマウス / テトラサイクリン発現システム |
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| 研究実績の概要 |
GABAは神経系の主要な抑制性伝達物質として覚醒、睡眠、概日リズムや学習、運動、感覚情報処理など脳の機能を構築する上で中心的役割を果たしている。GABAは、グルタミン酸脱炭酸酵素（GAD; GAD65とGAD67の2型存在）により合成され、小胞型GABAトランスポーター （VGAT）によりシナプス小胞に蓄積される。GAD65とGAD67は異なる遺伝子にコードされている。本研究では、主にノックアウトマウスを作製・解析することによりGABA神経伝達機構、GABAニューロンの役割、GABA自体の役割、およびGAD65分子とGAD67分子の役割を明らかにすることを目的とする。
GAD67完全型ノックアウトマウスは出生日に全例致死であり、出生日以降の解析ができない。そこで、テトラサイクリン発現システムを利用した時期特異的GAD67ノックアウトマウスの作製を目指している。時期特異的GAD67ノックアウトマウスの作製には、GAD67-tTAノックインマウス（既に作製）とGAD67-tetノックインマウスが必要である。GAD67-tetノックインマウス作製のために、ターゲッティングベクターを作成し、ES細胞に導入した。相同組換えの起こったESクローンを同定し、キメラマウスを作製した。
スティッフパーソン症候群や自己免疫性小脳失調症の患者では、血清中に抗GAD65抗体が高頻度で検出される。運動失調とGAD65分子との関連を明らかにする目的で、GAD65ノックアウトマウスと野生型マウス（いずれも5月齢）を用いて運動機能について比較検討した。まずGAD65ノックアウトマウスでは後肢クラスピングが観察されなかった。次にロータロッドテストを行ったが、両者の間に有意差がなかった。以上の結果から、GAD65ノックアウトマウスでは明白な運動機能の障害は認められなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
テトラサイクリン発現システムを利用した時期特異的GAD67ノックアウトマウスの作製に関して、GAD67-tetノックインマウスのキメラマウスを作製した。運動失調とGAD65分子との関連について研究を行った。また、これまでのデータを論文として報告するなど、全体としては概ね順調に進んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
GAD67-tetノックインマウスについてキメラマウスと野生型マウスとを交配し、GAD67-tetノックインマウスを得る。次に、GAD67-tTAノックインマウスとGAD67-tetノックインマウスとを交配し、時期特異的GAD67ノックアウトマウスを作製する。時期特異的GAD67ノックアウトマウスにおいて、ドキシサイクリン投与の有無でGAD67の発現がどのように変化するか分子生物学、生化学、組織学のレベルで解析する。一方、GAD65分子とGAD67分子の役割を明らかにする目的で、GAD65ノックアウトマウス、GAD67ノックアウトマウス、GAD65/GAD67ダブルノックアウトマウスにおける遺伝子発現や行動などについて引き続き検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
前年度にターゲッティングベクター作成のための情報収集に時間がかかり、GAD67-tetノックインマウスの作製が当初の予定よりもやや遅れている。それに伴い、時期特異的GAD67ノックアウトマウスを解析するための分子生物学実験用の試薬、組織学的解析用の試薬、器具などの消耗品代が次年度に繰り越された。
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| 次年度使用額の使用計画 |
時期特異的GAD67ノックアウトマウスを解析するための分子生物学実験用の試薬（制限酵素、ポリメラーゼなど）、組織学的解析用の試薬（1次抗体、２次抗体など）、器具などに使用する。また、時期特異的GAD67ノックアウトマウス作製や繁殖のための飼育費に使用する。
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