研究課題
A.アストロサイトの誕生する神経上皮の部位・マーカー遺伝子・アストロサイトの最終的に分布する脳部位との対応地図の作成申請者は既に、３種類のcreマウスとfloxed-GLT1マウスを交配し、GLT1の免疫染色を行うことにより、大脳皮質、間脳・脳幹、小脳のアストロサイトの誕生部位とマーカー遺伝子を同定している。平成26年度は、線条体・視床下部・延髄のアストロサイトの誕生部位とマーカー遺伝子を同定するため、Emx2-Cre, Gsh2-Cre, Nkx2.1-Cre,En1-Creとfloxed-GLT1マウスを交配し、GLT1の免疫染色を行った。線条体の背側部のアストロサイトはGsh2発現神経幹細胞マウス由来であること、視床下部の一部のアストロサイトはNkx2.1発現神経幹細胞由来であること、延髄・小脳のアストロサイトはEn1発現神経幹細胞由来である事を明らかにした。B. 大脳皮質・線条体・小脳・延髄・視床下部のアストロサイトの発現遺伝子プロファイリング特定の脳部位のアストロサイトをセルソーターで単離するため、脳部位特異的にアストロサイトに蛍光蛋白質GFPを発現させる新規アストロサイトレポーターマウスを作成する。平成26年度は、β-actin遺伝子のpolyAシグナルの下流にtetO-DIO-GFP（tetOプロモーターの下流に蛍光蛋白質GFP cDNAを逆向きに挿入したベクター。cDNAの両端にはloxP, lox2722サイトがあり、Creにより正常な向きになる）をノックインしたマウス(βactin: tetO-DIO-GFP)を、改良型ゲノム編集技術(CRISPR/Cas9)を用いて作成した。
2: おおむね順調に進展している
当初予定した、線条体・視床下部・延髄の一部のアストロサイトの誕生する神経上皮のマーカー遺伝子を同定することができた。また、CRISPR/Cas9システムを改良し、長い外来遺伝子を約50%の高効率で標的部位にノックインする方法を確立し、目的のレポーターマウスの作製を完了した。
培養やセルソーターを経ずに、脳をホモゲナイズするだけで特定の脳部位のアストロサイトからのみmRNAを精製するため、新規アストロサイトレポーターマウスを作成する。具体的にはβ-actin遺伝子のpolyAシグナルの下流にtetO-DIO-GFP-L10をノックインしたマウス(βactin: tetO-DIO-GFP-L10)を、改良型CRISPR/Cas9を用いて作成する。大脳皮質・線条体・小脳・延髄・視床下部のアストロサイトにCreを発現しているマウスとMlc1-tTAマウス (アストロサイト特異的にtTAを発現しているマウス)およびβactin: tetO-DIO-GFP-L10マウスを交配し、TRAP(translating ribosome affinity purification)法で、特定の脳部位のアストロサイトのリボゾームに結合しているRNAを精製する。DNAチップを用い、発現遺伝子のプロファイリングを行い、各脳部位特異的に発現している遺伝子群を同定する。
すべて 2015 2014
すべて 雑誌論文 (6件) (うち査読あり 6件、 オープンアクセス 3件、 謝辞記載あり 6件) 学会発表 (14件) 産業財産権 (1件)
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