研究課題
平成２６年度の目標は、ヒト病理を再現する新たなALSモデルマウスを作製するために、コンストラクションの作製、発現細胞特異性の評価とALS封入体病理の確認を行い、受精卵へのプラスミドインジェクションを行うことであった。当該年度に達成できた項目は以下のとおりである。1) synapsinプロモーターによって誘導される細胞質型易凝集性TDP-43のプラスミド(hSyn-TPD-43 mNLS-DCS)コンストラクションを終えた。2)マウス初代培養ニューロンへの遺伝子導入実験を行い、本コンストラクトが神経特異的に発現し、かつ細胞質封入体がALS病理を再現することを確認した。3)ミスフォールドTDP-43特異認識抗体3B12AのscFvのコンストラクションを終え、scFvにおけるミスフォールドTDP-43特異的結合性を確認した。4)hSyn-mNLS-TDP-43のコンストラクトのマウス受精卵へのマイクロインジェクションを行い、トランスジェニックマウスの作製を開始した。5)マウスTDP-43特異抗体のモノクローナル抗体作製を開始し、一次スクリーニングで組織染色、ウェスタンブロッティングの両方で利用可能なハイブリドーマ株を選定した。TDP-43封入体形成に関わる異常封入体形成を阻害する低分子スクリーニングについては、会合部位を認識するポリクローナル抗体を作製したが、ELISAにて結合度が低いことが判明したため、本年度再度抗体作製を検討する。
2: おおむね順調に進展している
本申請は、代表者らがこれまでに同定したTDP-43のRNAの結合部位RRM1, RRM2の病態関連配列に対する独自の抗体を活用した、①低分子のハイスループットスクリーニングによる局所結合分子の同定、②Intrabodyの開発と効果検証、③新たなTDP-43のモデル動物の開発の３本柱からなり、ALS/FTLDの新たな分子標的治療法と診断法（プローブ）の開発を目指すものであるが、②③は予定通りに進捗しており、①はELISAに用いる競合抗体が期待ほど有用なものにならなかったため、概ねという評価をした。しかし低分子スクリーニングに用いる新たなライブラリーを導入予定であり、今年度は既存の抗体で低分子スクリーニングを行う予定である。
1)引き続きトランスジェニックマウスの作製を進める。本年度は繁殖実験と、表現型の評価（運動麻痺、認知機能低下の有無）、病理所見の解析をすすめる。2)細胞内抗体(3B12A scFvの解析を引き続き進める。まず不死化細胞にてミスフォールドTDP-43との結合を介して分解を促進させる組換抗体の作製を行う。具体的には不死化細胞内に野生型あるいはミスフォールド型のTDP-43とscFvを同時に投与しTDP-43の発現量の変化をWestern blottingで調べる。3B12Aは重鎖由来のVHにプロテアソーム移行シグナルPEST配列を有してているため、それ自体が抗原の分解促進効果を有する可能性がある。分解効果が不十分な場合、CL1などのプロテアソーム移行シグナルを付加した組換抗体を作成して同様の検討を行う。またin vivoでの使用のためプロモーターをhSyn1に組み替えたscFvプラスミドを作製し初代培養系に遺伝子導入し神経特異的発現を確認した後、子宮内エレクトロポレーション法による胎児マウス脳での発現解析、ウイルスベクターによる遺伝子治療を念頭に置いた治療戦略のおしすすめる。3)新たな低分子化合物ライブラリーを用いて、TDP-43の異常会合部位に結合する分子を変法ELISAを用いて選抜する。
トランスジェニックマウス受託作製にあたり、コンストラクトの作製と発現確認、ならびに山形大学遺伝子実験施設との契約に時間を要し、マウス維持用の予算が繰越となったため。
現在受精卵へのマイクロインジェクション作業に入っており、外来遺伝子を有するマウスの出産が確認できた後、本学に移送される予定である（５～6月を見込んでいる）。その後、ケージ代、エサ代、ジェノタイピングに関わる試薬代等に使用する予定である。さらに昨年度作製を開始したモノクローナル抗体のハイブリドーマクローニング作業が難航しており（受託中）、新たに作製する予定である。
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