悪性乳癌における癌幹細胞の維持機構

2015 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 26290036
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 井上 純一郎 東京大学, 医科学研究所, 教授 (70176428)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 癌 / シグナル伝達

研究実績の概要

Basal-like乳癌細胞株であるHCC38細胞やHCC1143細胞および一部の乳癌臨床検体においてBasal-like乳癌様のEpCAMを強く発現する細胞集団と、Claudin-low乳癌様のEpCAM発現が低い集団が共存していることに注目し、乳癌幹細胞の維持機構解明の観点から異なる性質の細胞が共存する機構について解析を行った。初めに各集団をFACSによって分取し遺伝子発現を検討した結果、EpCAM発現の高い集団はCLDNやBasalケラチンを高く発現する上皮様の性質を示し、EpCAM発現の低い集団はZEB1/2を高く発現し、CLDNやBasalケラチンの発現が低い間葉系細胞の性質を持つことが分かった。ZEB1/2の発現と上皮マーカーの発現が集団間で逆相間を示すことから上皮間葉転換EMTの関連が示唆された。そこで次にこれらの細胞集団が相互に変換可能であるかを調べるためにsingle cell sortingによって各集団の細胞をcloningしてEpCAMの発現プロファイルを調べた。その結果、ほとんどのcloneにおいてその頻度は異なるものの両画分が存在する事が分かり、これらの2つの集団は相互に変換可能であることが分かった。さらに、EMTを誘導する転写因子であるSnailの過剰発現によってEpCAM低発現の集団が顕著に増加することも分かり、EMTとMETによって相互に変換することで培養条件下において両者のバランスが維持されていることが分かった。このEMTやMET制御機構を調べるために、各細胞集団を単独もしくはお互いの集団を混合して培養を行ったところ、間葉様の集団は周囲の上皮様細胞のEMTを促進し、逆に上皮様の集団は周囲の間葉様細胞のMETを促進することが示唆された。さらにお互いの集団の細胞上清ではこのような変化は見られなかったことから細胞間接触の重要性が考えられた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

一般的に上皮様細胞は増殖能が高く、一方で間葉様細胞は増殖能は低いものの細胞生存能が高く、抗腫瘍免疫に働く樹状細胞を抑制することなどが報告されていることから、今後、より詳細な解析を行いBasal-like乳癌におけるEMTとMETによる上皮様・間葉様の両細胞のバランスの維持が腫瘍の悪性化に果たす重要性を明らかにしたい。

今後の研究の推進方策

1）癌幹細胞特異的なNOTCH標的遺伝子をsiRNAあるいはshRNAでノックダウンし癌幹細胞維持に必須な役割を果たす標的遺伝子を同定し、癌幹細胞維持の分子機構を明らかにする。2）NOTCH1,NOTCH2,NOTCH3,NOTCH4の中で癌幹細胞維持における役割に差がある場合には、その原因が発現量によるのか受容体の構造の違いによるのかを明らかにし、その生理的な意味を明らかにする実験を行う。3）Basa1タイプ乳癌特異的なNOTCHシグナル経路の同定を目指す。Luminalタイプ及びClaudin-lowタイプ乳癌細胞との比較から特異性に関与するタンパク質を同定する。4）手術検体の例数を増やし、細胞株で観察されたNOTCHシグナルの癌幹細胞維持機能のBasalタイプ特異性がprimaryの乳癌細胞にも適応できるかを検討する。また、計画3）で同定される幹細胞特異的なNOTCHシグナル制御に関わるタンパク質の挙動を手術由来検体で解析し、Basalタイプ乳癌での癌幹細胞特異的なNOTCHシグナル制御がprimaryの乳癌細胞にも適応できるかを検討する。

次年度使用額が生じた理由

Basalタイプ乳癌細胞株における遺伝子ノックダウンについてた種類の遺伝子で成功していたが、４種類のNOTCH受容体の特異的ノックダウンについては条件検討に時間を要した。条件検討をほぼ終えたのでその後の計画を次年度に実施することにした。

次年度使用額の使用計画

1）NOTCH1~4のうちどの受容体が主要な役割を果たしているかを解明する。
2) 役割に差がある場合には、その原因が発現量によるのか受容体の構造の違いによるのかを明らかにし、その生理的な意味を明らかにする実験を行う。

研究成果

• [雑誌論文] Integrative Network Analysis Combined with Quantitative Phosphoproteomics Reveals TGFBR2 as a Novel Regulator of Glioblastoma Stem Cell Properties. (2016)
  • 著者名/発表者名: Narushima, Y., Kozuka-Hata, H., Koyama-Nasu, R., Tsumoto, K., Inoue, J, Akiyama, T., Oyama, M
  • 雑誌名: Mol. Cell. Proteomics 巻: 15 ページ: 1017-1031
  • DOI: 10.1074/mcp.M115.049999
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Quantitative phosphoproteomics-based molecular network description for high-resolution kinase-substrate interactome analysis. (2016)
  • 著者名/発表者名: Narushima, Y., Kozuka-Hata, H., Tsumoto, K., Inoue, J. and Oyama, M.
  • 雑誌名: Bioinformatics 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1093/bioinformatics/btw164.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structures of CYLD USP with Met1- or Lys63-linked diubiquitin reveal mechanisms for dual specificity (2015)
  • 著者名/発表者名: Sato, Y., Goto, E., Shibata, Y., Kubota, Y., Yamagata, A., Goto-Ito, S., Kubota, K., Inoue, J., Takekawa, M., Tokunaga, F. and Fukai, S
  • 雑誌名: Nat. Struct. Mol. Biol 巻: 22 ページ: 222-229
  • DOI: 1038/nsmb.2970
  • 査読あり
• [雑誌論文] HIV-1 replicates in human osteoclasts and enhances their differentiation in vitro. (2015)
  • 著者名/発表者名: Gohda, J., Ma, Y., Huang, Y., Zhang, Y., Gu, L., Han, Y., Li, T., Gao, G.F., Inoue, J., Iwamoto, A. and Ishida, T
  • 雑誌名: Retrovirology 巻: 12 ページ: 12
  • DOI: 10.1186/s12977-015-0139-7
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Catalytic subunits of the phosphatase calcineurin interact with NF-kB-inducing kinase (NIK) and attenuate NIK-dependent gene expression. (2015)
  • 著者名/発表者名: Shinzawa. M., Konno, H., Qin, J., Akiyama, N., Miyauchi, M., Ohashi, H., Miyamoto-Sato, E., Yanagawa, H., Akiyama, T.* and Inoue, J.
  • 雑誌名: Sci. Rep. 巻: 5 ページ: 10758
  • DOI: 10.1038/srep10758
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Visualization of RelB expression and activation at the single-cell level during dendritic cell maturation in Relb-Venus knock-in mice. (2015)
  • 著者名/発表者名: Seki, T., Yamamoto, M., Taguchi, Y., Miyauchi, M., Akiyama, N, Yamaguchi, N., Gohda, J., Akiyama, T. and Inoue, J.
  • 雑誌名: J. Biochem 巻: 158 ページ: 485-495
  • DOI: 10.1093/jb/mvv064
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Loss of Tifab, a del(5q) MDS gene, alters hematopoiesis through derepression of Toll-like receptor–TRAF6 signaling (2015)
  • 著者名/発表者名: Varney, M.E., Niederkorn, M., Konno, H., Matsumura, T., Gohda, J., Yoshida, N., Akiyama, T., Christie, S., Fang, J., Miller, D., Jerez, A., Karsan, A., Maciejewski, J.P., Inoue, J. and Starczynowski, D.T.
  • 雑誌名: J. Exp. Med 巻: 212 ページ: 1967-1985
  • DOI: 10.1084/jem.20141898
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Hypergravity provokes a temporary reduction of CD4+CD8+ thymocytes and a persistent decrease in medullary thymic epithelial cell frequency in mice. (2015)
  • 著者名/発表者名: Tateishi, R., Akiyama, N., Miyauchi, M., Yoshinaga, R., Sasanuma, H., Kudo, T., Shimbo, M., Shinohara, M., Obata, K., Inoue, J., Shirakawa, M., Shiba, D., Asahara, H., Yoshida, N., Takahashi, S., Morita, M. and Akiyama, T.
  • 雑誌名: PLoS ONE 巻: 10(10) ページ: e0141650
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0141650
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Analysis of HTLV-1 Tax-induced IKK activation pathway (2016)
  • 著者名/発表者名: 柴田佑里、井上純一郎
  • 学会等名: American Association for Cancer Research
  • 発表場所: Whistler Conference Centre（カナダ バンクーバー）
  • 年月日: 2016-03-13 – 2016-03-17
  • 国際学会
• [学会発表] .Visualization of RelB expression and activation at the single-cell level during dendritic cell maturation in Relb-Venus knock-in mice (2016)
  • 著者名/発表者名: 関崇生、山本真実、田口祐、宮内真紀、秋山伸子、山口憲孝、合田仁、秋山泰身、井上純一郎
  • 学会等名: American Association for Cancer Research
  • 発表場所: Whistler Conference Centre（カナダ バンクーバー）
  • 年月日: 2016-03-13 – 2016-03-17
  • 国際学会
• [学会発表] TRAF6 regulates pregnancy-induced mammary gland development and maintenance of epithelial stem cells (2016)
  • 著者名/発表者名: 山本瑞生、井上純一郎
  • 学会等名: Keystone symposia Stem Cells and Cancer (C1)
  • 発表場所: Beaver Run Resort（米国 コロラド州）
  • 年月日: 2016-03-06 – 2016-03-10
  • 国際学会
• [学会発表] Stimulation-dependent internalization of RANK is crucial for differentiation of osteoclast involved in bone metastasis (2016)
  • 著者名/発表者名: 田口祐、井上純一郎
  • 学会等名: Breakthroughs in Cancer Research:from Biology to Therapeutics
  • 発表場所: Hyatt Regency Maui（米国 ハワイ州）
  • 年月日: 2016-02-16 – 2016-02-20
  • 国際学会
• [学会発表] 妊娠期の乳癌成熟および幹細胞維持におけるTRAF6の役割 (2015)
  • 著者名/発表者名: 山本瑞生、井上純一郎
  • 学会等名: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会 合同大会
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド（兵庫県神戸市）
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [学会発表] 転写因子NF-κBの制御メカニズムとその生理機能 (2015)
  • 著者名/発表者名: 井上純一郎
  • 学会等名: 数理医学研究会 第51回数理医学セミナー
  • 発表場所: 大阪大学（大阪府豊中市）
  • 年月日: 2015-11-25 – 2015-11-25
  • 招待講演
• [学会発表] 乳癌における細胞間相互作用による上皮感葉転換の制御 (2015)
  • 著者名/発表者名: 山本瑞生、井上純一郎
  • 学会等名: 第74回日本癌学会学術総会
  • 発表場所: 名古屋国際センター（愛知県名古屋市）
  • 年月日: 2015-11-11 – 2015-11-14
• [学会発表] Regulation of the TRAF-NF-κB and the Calcineurin-NFATc1 pathways in RANK signal-induced osteoclastogenesis (2015)
  • 著者名/発表者名: 井上純一郎
  • 学会等名: East Asia joint symposium
  • 発表場所: Oist Campus（沖縄県国頭郡）
  • 年月日: 2015-11-11 – 2015-11-14
  • 国際学会
• [学会発表] HTLV-1Tax誘導性のIKK複合体活性化におけるポリユビキチン鎖の機能解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 柴田佑里、井上純一郎
  • 学会等名: 日本HTLV-1学会学術集会
  • 発表場所: 東京大学医科学研究所（東京都港区）
  • 年月日: 2015-08-22 – 2015-08-23
• [学会発表] 刺激依存的な受容体RANKの細胞質内局在化が果たす破骨細胞分化における役割 (2015)
  • 著者名/発表者名: 田口祐、井上純一郎
  • 学会等名: 日本骨代謝学会学術集会
  • 発表場所: 京王プラザホテル（東京都新宿区）
  • 年月日: 2015-07-23 – 2015-07-25
• [学会発表] 破骨細胞の分化成熟におけるTRAF6の役割 (2015)
  • 著者名/発表者名: 弓桁洋、田口祐、井上純一郎
  • 学会等名: 日本骨代謝学会学術集会
  • 発表場所: 京王プラザホテル（東京都新宿区）
  • 年月日: 2015-07-23 – 2015-07-25