老化関連マイクロRNA標的遺伝子の機能解析とがん治療への応用

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 26290047
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 田原 栄俊 広島大学, 医歯薬保健学研究院(薬), 教授 (00271065)
• 研究分担者: 塩谷 文章 独立行政法人国立がん研究センター, その他部局等, 研究員 (10627665)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: がんの個別診断 / マイクロRNA / 核酸医薬 / siRNA

研究実績の概要

PRPF19遺伝子を標的にしたsiRNAによる膵がんなどへの顕著な抗腫瘍効果のメカニズムを明らかにするために、（Ａ）PRPF19 siRNA処理がん細胞におけるpathway解析、（Ｂ）PRPF19siRNAによる紡錘体形成阻害、DNAダメージに及ぼす機能解析、（Ｃ）PRPF19 siRNAによる抗腫瘍効果におけるユビキチン活性の関与の検証、（Ｄ）PRPF19 siRNAによる抗腫瘍効果におけるスプライシング機能の関与の検証、について実施した。　Ａ）については、PRPF19 siRNA処理した正常線維芽細胞および膵がん細胞株PK8のpathway解析をマイクロアレイ（東レ3Dgene）によりトランスクリプトーム解析を行った。その結果をもとに、GO解析を行ったところ、細胞周期、DNAダメージ経路の寄与が明らかになった。また、共通に変化している遺伝子も見られたが、がん細胞と正常線維芽細胞で、顕著なトランスクリプトームの違いが見られた。（Ｂ）については、PRPF19siRNAによる細胞周期に及ぼす影響をFACSおよび蛍光細胞周期プローブ「Fucci」を用いた実験で、PRPF19siRNAにより正常細胞はG2/M期に同調するが、がん細胞はG2/M阻害が見られずＳ期の進行が見られ、それに伴うDNAダメージにより細胞死が誘導された。また、コメットアッセイにより、PRPF19siRNAによるDSB(二本鎖開裂)を示唆するデータが得られた。（Ｃ）に関しては、PRPF19遺伝子のUbox, C末,を欠失させたΔU変異型ΔC変異体およびΔUΔC変異体を構築し、これらを安定に発現する線維芽細胞で構築した。その結果、長期間培養で、細胞は老化様の巨大細胞を形成した。以上、平成26年度は、PRPF19の正常線維芽細胞及び膵がんでのsiRNAによる老化誘導のメカニズムの一部を明らかにできた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

(A)から(D)のプロジェクトのうち、（Ｃ）の一部の解析の除き、ほぼ計画通りに進行した。

今後の研究の推進方策

Ａ）PRPF19 siRNA処理がん細胞におけるpathway解析については、③　PRPF19siRNAに処理がん細胞に共通なシグナル分子の同定。上記①、②のデータに基づき、がん細胞で共通に変動する分子について、RT-PCRおよびウエスタン解析によりその発現を検討する。上記実験で共通分子が同定できた場合は、それらのsiRNAあるいは強制発現ベクターを構築し、siPRPF19による増殖抑制メカニズムに寄与する分子であるか確認を行う。
（Ｂ）PRPF19siRNAによる紡錘体形成阻害、DNAダメージに及ぼす機能解析については、DSBダメージのマーカーとして知られるγH2AX、53BPなどを用いて、siPRPF19処理による蛍光免疫染色を行い解析する。
（Ｃ）PRPF19 siRNAによる抗腫瘍効果における ユビキチン活性の関与の検証については、①ΔU変異型PRPF19の強制発現における細胞周期解析、②表現型が出たものについてFACSおよび「Fucci」細胞を用いた解析を行う。
（Ｄ）PRPF19 siRNAによる抗腫瘍効果におけるスプライシング機能の関与の検証いついては、①次世代シークエンサーを用いたPRPF19 siRNAによるスプライシング異常の解析を行う。具体的には、siPRPF19によるスプライシング異常を次世代シークエンサIonPGMにより解析し、スプライシング異常とsiPRPF19の表現型との違いを検討する。

次年度使用額が生じた理由

年度末に使用予定のmiRNA検出プライマーの納期が遅延したため。

次年度使用額の使用計画

次年度に、用いるmiRNA検出プライマーに用いる計画である。

研究成果

• [雑誌論文] A potential function for neuronal exosomes: sequestering intracerebral amyloid-beta peptide. (2015)
  • 著者名/発表者名: Yuyama, K., Sun, H., Usuki, S., Sakai, S., Hanamatsu, H., Mioka, T., Kimura, N., Okada, M., Tahara, H., Furukawa, J., Fujitani, N., Shinohara, Y. & Igarashi, Y.
  • 雑誌名: FEBS letters 巻: 589 ページ: 84-88
  • DOI: 10.1016/j.febslet.2014.11.027.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Werner Syndrome-specific induced pluripotent stem cells: recovery of telomere function by reprogramming. (2015)
  • 著者名/発表者名: Shimamoto, A., Yokote, K. & Tahara, H.
  • 雑誌名: Frontiers in genetics 巻: 6 ページ: 10
  • DOI: 10.3389/fgene.2015.00010
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Decreased amyloid-beta pathologies by intracerebral loading of glycosphingolipid-enriched exosomes in Alzheimer model mice. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yuyama, K., Sun, H., Sakai, S., Mitsutake, S., Okada, M., Tahara, H., Furukawa, J., Fujitani, N., Shinohara, Y. & Igarashi, Y.
  • 雑誌名: J Biol Chem 巻: 289 ページ: 24488-24498
  • DOI: 10.1074/jbc.M114.577213.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Generation of human induced pluripotent stem (Ips) cells in serum- and feeder-free defined culture and TGF-Beta1 regulation of pluripotency. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yamasaki, S., Taguchi, Y., Shimamoto, A., Mukasa, H., Tahara, H. & Okamoto, T.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 9 ページ: e87151
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0087151
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Reprogramming suppresses premature senescence phenotypes of Werner syndrome cells and maintains chromosomal stability over long-term culture. (2014)
  • 著者名/発表者名: Shimamoto, A., Kagawa, H., Zensho, K., Sera, Y., Kazuki, Y., Osaki, M., Oshimura, M., Ishigaki, Y., Hamasaki, K., Kodama, Y., Yuasa, S., Fukuda, K., Hirashima, K., Seimiya, H., Koyama, H., Shimizu, T., Takemoto, M., Yokote, K., Goto, M. & Tahara, H.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 9 ページ: e112900
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0112900
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] DSE-FRET: A new anticancer drug screening assay for DNA binding proteins. (2014)
  • 著者名/発表者名: Miyagi, T., Shiotani, B., Miyoshi, R., Yamamoto, T., Oka, T., Umezawa, K., Ochiya, T., Takano, M. & Tahara, H.
  • 雑誌名: Cancer Sci 巻: 105 ページ: 870-874
  • DOI: 10.1111/cas.12420
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. (2014)
  • 著者名/発表者名: Lotvall, J., Hill, A.F., Hochberg, F., Buzas, E.I., Di Vizio, D., Gardiner, C., Gho, Y.S., Kurochkin, I.V., Mathivanan, S., Quesenberry, P., Sahoo, S., Tahara, H., Wauben, M.H., Witwer, K.W. & Thery, C.
  • 雑誌名: Journal of extracellular vesicles 巻: 3 ページ: 26913
  • DOI: 10.3402/jev.v3.26913
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] EVpedia: a community web portal for extracellular vesicles research. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kim, D.K., Lee, J., Kim, S.R., Choi, D.S., Yoon, Y.J., Kim, J.H., Go, G., Nhung, D., Hong, K., Jang, S.C., Kim, S.H., Park, K.S., Kim, O.Y., Park, H.T., Seo, J.H., Aikawa, E., Baj-Krzyworzeka, M., van Balkom, B.W., Belting, M., Blanc & Tahara, H.
  • 雑誌名: Bioinformatics 巻: 31(6) ページ: 933-939
  • DOI: 10.1093/bioinformatics/btu741
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] TERT attenuated ER stress-induced cell death. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hosoi, T., Inoue, Y., Nakatsu, K., Matsushima, N., Kiyose, N., Shimamoto, A., Tahara, H. & Ozawa, K.
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun 巻: 447 ページ: 378-382
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2014.04.034
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] CBP-93872 inhibits NBS1-mediated ATR activation, abrogating maintenance of the DNA double-strand break-specific G2 checkpoint. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hirokawa, T., Shiotani, B., Shimada, M., Murata, K., Johmura, Y., Haruta, M., Tahara, H., Takeyama, H. & Nakanishi, M.
  • 雑誌名: Cancer Res 巻: 74 ページ: 3880-3889
  • DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-13-3604
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Telomeric g-tail length and hospitalization for cardiovascular events in hemodialysis patients. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hirashio, S., Nakashima, A., Doi, S., Anno, K., Aoki, E., Shimamoto, A., Yorioka, N., Kohno, N., Masaki, T. & Tahara, H.
  • 雑誌名: Clinical journal of the American Society of Nephrology : CJASN 巻: 9 ページ: 2117-2122
  • DOI: 10.2215/CJN.10010913
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Infection with Porphyromonas gingivalis exacerbates endothelial injury in obese mice. (2014)
  • 著者名/発表者名: Ao, M., Miyauchi, M., Inubushi, T., Kitagawa, M., Furusho, H., Ando, T., Ayuningtyas, N.F., Nagasaki, A., Ishihara, K., Tahara, H., Kozai, K. & Takata, T.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 9 ページ: e110519
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0110519
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 老化を調節する microRNA の膵臓がん細胞における機能解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 福永早央里, 塩谷文章, 嶋本顕, 田原栄俊
  • 学会等名: 第37回 日本分子生物学会
  • 発表場所: 横浜市
  • 年月日: 2014-11-26 – 2014-11-26
• [学会発表] microRNA による細胞老化誘導機構の解明 (2014)
  • 著者名/発表者名: 山本佑樹, 塩谷文章, 嶋本顕, 田原栄俊
  • 学会等名: 第37回 日本分子生物学会
  • 発表場所: 横浜市
  • 年月日: 2014-11-26 – 2014-11-26
• [学会発表] 老化誘導型核酸医薬の開発 (2014)
  • 著者名/発表者名: 田原 栄俊
  • 学会等名: 新適塾「未来創薬への誘い」第28回会合
  • 発表場所: 大阪府
  • 年月日: 2014-10-06 – 2014-10-06
  • 招待講演
• [学会発表] 細胞老化を誘導する microRNA の網羅的スクリーニング (2014)
  • 著者名/発表者名: 山本佑樹, 塩谷文章, 嶋本顕, 田原栄俊
  • 学会等名: 平成 26 年度 がん若手研究者ワークショップ
  • 発表場所: 長野県茅野市
  • 年月日: 2014-09-03 – 2014-09-06
• [学会発表] 細胞老化における細胞外小胞エクソソーム分泌の生物学的意義の探索 (2014)
  • 著者名/発表者名: 岡田恵,宗岡美紗,岡本沙矢香,二瀬由宇,塩谷文章,嶋本顕,田原栄俊３
  • 学会等名: 第６回日本RNAi研究会
  • 発表場所: 広島市
  • 年月日: 2014-08-29 – 2014-08-29
• [学会発表] Direct detection of extracellular vesicles and exRNA (2014)
  • 著者名/発表者名: 田原 栄俊
  • 学会等名: 第１回日本細胞外小胞学会
  • 発表場所: 広島市
  • 年月日: 2014-08-28 – 2014-08-28
  • 招待講演
• [学会発表] 老化を調節する microRNA による膵臓がん抑制機構の解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 福永早央里,塩谷文,嶋本顕,田原栄俊
  • 学会等名: 第６回日本RNAi研究会
  • 発表場所: 広島市
  • 年月日: 2014-08-28 – 2014-08-28
• [学会発表] 細胞老化を誘導する microRNA の網羅的スクリーニング (2014)
  • 著者名/発表者名: 山本佑樹, 塩谷文章, 嶋本顕, 田原栄俊
  • 学会等名: 第６回日本RNAi研究会
  • 発表場所: 広島市
  • 年月日: 2014-08-28 – 2014-08-28
• [学会発表] スペクトル型フローサイトメーター SP6800によるエクソソームの一粒子測定 (2014)
  • 著者名/発表者名: 品末聡也,岡田恵,宗岡美紗,植田俊樹,佐古直紀,新田尚,田原栄俊
  • 学会等名: 第６回日本RNAi研究会
  • 発表場所: 広島市
  • 年月日: 2014-08-28 – 2014-08-28
• [学会発表] 老化誘導型核酸医薬の開発に向けて (2014)
  • 著者名/発表者名: 田原 栄俊
  • 学会等名: 「がん研究分野の特性等を踏まえた支援活動」公開シンポジウム
  • 発表場所: 東京都
  • 年月日: 2014-08-21 – 2014-08-21
  • 招待講演
• [学会発表] 小さな巨人「マイクロRNA」によるがん診断およびがん治療戦略 (2014)
  • 著者名/発表者名: 田原 栄俊
  • 学会等名: NPO法人国際医科学研究会第８回フォーラム
  • 発表場所: 東京都
  • 年月日: 2014-06-29 – 2014-06-29
  • 招待講演
• [学会発表] Senescence-associated exosome, the mechanism of secretion and the function (2014)
  • 著者名/発表者名: Hidetoshi Tahara
  • 学会等名: KSEV2014 (Korean Society for ExtracellularVesicles)
  • 発表場所: Seoul, Korea
  • 年月日: 2014-05-30 – 2014-05-30
  • 招待講演
• [学会発表] Senescence-associated exosome, the mechanism of secretion and the function (2014)
  • 著者名/発表者名: Hidetoshi Tahara
  • 学会等名: International Symposium on Extracellular Vesicles for Biomedical Applications, KSEV2014 (Korean Society for ExtracellularVesicles)
  • 発表場所: Seoul, Korea
  • 年月日: 2014-05-29 – 2014-05-29
  • 招待講演
• [学会発表] テロメア・マイクロRNA の検査が切り開く がん診断・治療 (2014)
  • 著者名/発表者名: 田原 栄俊
  • 学会等名: がんと炎症・代謝研究会 講演会
  • 発表場所: 京都市
  • 年月日: 2014-05-25 – 2014-05-25
  • 招待講演
• [学会発表] Direct Detection of Exosome by SP6800 Spectral Analyzer (2014)
  • 著者名/発表者名: 品末聡也
  • 学会等名: CYTO2014
  • 発表場所: Ft. Lauderdale, Florida, USA
  • 年月日: 2014-05-19 – 2014-05-19
• [学会発表] Biogenesis and biological activity of exosomes in replicative senescent cells. (2014)
  • 著者名/発表者名: Megumi Okada
  • 学会等名: ISEV (INTERNATIONAL SOCIETY FOR EXTRACELLULAR VESICLES) 2014
  • 発表場所: ロッテルダム(オランダ)
  • 年月日: 2014-05-01 – 2014-05-01
• [図書] MicroRNA in Regenerative Medicine (2014)
  • 著者名/発表者名: Dan Xu, Yeqing Sun, Hidetoshi Tahara
  • 総ページ数: 1259
  • 出版者: Academic Press