| 研究課題/領域番号 |
26290066
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| 研究機関 | 東海大学 |
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研究代表者 |
木村 穣 東海大学, 医学部, 教授 (10146706)
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| 研究分担者 |
佐藤 健人 東海大学, 医学部, 准教授 (50235363)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | iPS細胞 / 再生 / CRISPR/Cas9 / 遺伝子工学 / HLA抗原 / 発現抑制 / 遺伝子変異 / 移植片拒絶 |
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| 研究実績の概要 |
本計画では、CRISPR/Cas9によるHLA領域のゲノム編集をiPS細胞に適用している。HLA classI軽鎖遺伝子をノックアウトしたiPS細胞の作成について、本年は論文として発表した(Sato T, Kimura M et al. Integrative Molecular Medicine )。 当該ケースを含め、CRISPR/Cas9法により標的遺伝子の破壊がうまくいった細胞の選別は、特異抗体によるフローサイトメトリーを用いて容易に行えるものであった。
しかし、今後は特異抗体の存在しないHLA遺伝子の編集、ノックアウトを効率よく行う必要が生じる。このため、抗体によらない選別方法を確立する必要が考えられる。そこで、CRISPR/Cas9法を実施する際、targeting sequenceを共存させ、標的となる場所に薬剤選択マーカー並びに蛍光色素を導入するシステムを構築した。この場合、当該配列に変異導入した細胞を薬剤により選択することができる。挿入配列は、選択後PiggyBac transposaseによって、痕跡なく除去することが可能なデザインとなっている。本法は、本研究計画における高汎用性iPS細胞の作成に限らず、様々な細胞株の自由なゲノム編集に有効な技術であると考える。
また、点突然変異を導入するシステムも並行して進行しており、今年度に２つの遺伝子で点突然変異マウスを取得することに成功している。まだ条件はつかめないがいくつかの個体はホモ点突然変異個体である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
末梢血T細胞よりCRISPR/Cas9システムにより、ClassI遺伝子を発現しないiPS細胞を昨年度樹立し、その成果を公表することができたが、一番懸念されるNK細胞への感受性(NK細胞のtarget となるか否か？）をin vitroおよびin vivo系で評価する点での進捗はやや少なかったため。
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| 今後の研究の推進方策 |
CRISPR/Cas9系の有効性は本年度に十分に示されたため、今後はNK活性のassay系を中心にin vitroでのアッセイ系をまず確立する。H27年度に専門家から十分な情報を得ているため、系の確立そのものは十分可能である。一方in vivoでは直接的に移植する方法を含めてどのようなアッセイ系が考えられるかを十分検討したい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
確定金額が概算金額をほんの少し下回ったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
消耗品費等に加算して使用する。
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