| 研究課題/領域番号 |
26290070
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
山本 卓 広島大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (90244102)
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| 研究分担者 |
谷口 俊介 筑波大学, 生命環境科学研究科(系), 准教授 (00505331)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | バイオテクノロジー / ゲノム編集 |
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| 研究実績の概要 |
ウニ胚における遺伝子ノックインを検討するため、Nanos遺伝子を標的としたPlatinum TALENを作製し、標的配列への切断活性を培養細胞でのSSAアッセイとウニ胚への変異導入について検討した。SSAアッセイとウニ胚への変異解析の結果、ポジティブコントロールのTALENと比較して十分な活性のTALENであることが確認された。そこで、TALEN mRNAとNanosへの蛍光遺伝子挿入用ドナーベクターをウニ受精卵に導入し、原腸胚期において正しく挿入されているかどうかをゲノムDNAを回収し、PCRおよびシーケンスによってノックインの連結部分での配列を確認した。その結果、ノックインを示すPCR産物が検出され、シーケンスによって正しい配列のアレルが検出された。しかしながら、ウニ胚において挿入した蛍光遺伝子から作られる蛍光タンパク質を検出することができなかった。この原因としては、Nanosが発現する細胞が細胞数の非常に少ない小小割球に限定されており、小小割球系譜へのノックイン効率が低い場合は検出が難しいことに原因があると考えた。そのため、胞胚において反口側外胚葉に発現するArs遺伝子へのノックインをHR経路とMMEJ経路で検討している。カエルにおいては、MMEJを利用したチロシナーゼ遺伝子座へのレポーター遺伝子の挿入によって、色素細胞と網膜上皮細胞において、色素の欠失と同時に蛍光を観察することに成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ウニ胚を利用した遺伝子ノックインについては、挿入は見られるものの、蛍光の観察には至っていないが、効率を情報させるなどの工夫によって改善できると考えられる。一方、カエルでのMMEJによる遺伝子ノックインは予定通り進行している。これらの結果から、全体としてはおおむね順調に進展していると判断できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの研究から、MMEJ経路を利用した遺伝子ノックインについては、生物種によって効率が異なる可能性が考えられた。そこで培養細胞での実験によってMMEJでのノックイン効率化のための研究を並行して進めることとした。培養細胞での効率化の方法を、個体に適用することによって、動物種に依存しない効率的なノックイン法が確立できると考える。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度の研究はおおむね順調に進んでおり、平成28年度の培養細胞でのMMEJの効率化検討のために使用することが本研究の成果につながると考えた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
動物個体でのノックイン実験と培養細胞での効率化実験のための実験試薬、研究補助員の雇用に平成27年度と平成28年度の経費を合わせて使用する。
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