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2016 年度 実績報告書

ゲノム編集を利用した遺伝子ノックイン新技術の開発

研究課題

研究課題/領域番号 26290070
研究機関広島大学

研究代表者

山本 卓  広島大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (90244102)

研究分担者 谷口 俊介  筑波大学, 生命環境科学研究科(系), 准教授 (00505331)
研究期間 (年度) 2014-04-01 – 2017-03-31
キーワードバイオテクノロジー / ゲノム編集
研究実績の概要

ゲノム編集技術を利用した培養細胞や動物個体でのノックインの効率化を図る目的で、MMEJ経路を利用した新しい遺伝子ノックイン法(PITCh法)を開発してきた。本年は、この方法をウニおよびマウスにおいて利用可能かどうかを検討した。ウニにおいては、昨年の研究結果から、遺伝子ノックインが困難であることが明らかになっていたため、TALENの活性を熱処理によって上昇させる方法を試みた。TALEN mRNAとArs遺伝子を標的とするTALEN mRNAを顕微注した胚を、胞胚において25度で30分間飼育し、レポーター遺伝子が導入されるかどうかを確認した。その結果、蛍光を発する細胞がわずかに観察され、PCRとシーケンスによってゲノムに正確にArs遺伝子座にノックインされているPCR産物が確認された。以上の結果から、非常に頻度は低いものの遺伝子ノックインが起こることが確認できた。しかしながら、胚全体へレポーター遺伝子を挿入するためにはさらなる改良が必要と考えられた。
培養細胞Hek293においてノックイン効率を向上させるため、MMEJ経路に関わる因子の過剰発現を行い、MMEJ修復を上昇させるExonucleaseIを同定した。PITCh法においてExonucleaseIの過剰発現の効果を調べたところ、薬剤選抜をすることなく30%程度の効率でノックイン細胞を得ることができた。さらに、マウス受精卵でのPITCh法によるノックインにおいて、Exonuclease I mRNAを共導入することによって、最大で35%のノックイン効率の上昇が観察された。

現在までの達成度 (段落)

28年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

28年度が最終年度であるため、記入しない。

次年度使用額が生じた理由

28年度が最終年度であるため、記入しない。

次年度使用額の使用計画

28年度が最終年度であるため、記入しない。

  • 研究成果

    (8件)

すべて 2017 2016 その他

すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件、 オープンアクセス 2件) 学会発表 (3件) (うち招待講演 3件) 図書 (1件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] Gene cassette knock-in in mammalian cells and zygotes by enhanced MMEJ2016

    • 著者名/発表者名
      Aida T, Nakade S, Sakuma T, Izu Y, Oishi A, Mochida K, Ishikubo H, Usami T, Aizawa H, Yamamoto T and Tanaka K
    • 雑誌名

      BMC Genomics

      巻: 17 ページ: 979

    • DOI

      10.1186/s12864-016-3331-9

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Ultra-superovulation for the CRISPR-Cas9-mediated production of gene-knockout,single-amino-acid-substituted, and floxed mice2016

    • 著者名/発表者名
      Nakagawa Y, Sakuma T, Nishimichi N, Yokosaki Y, Yanaka N, Takeo T, Nakagata N, and Yamamoto T
    • 雑誌名

      Biol Open

      巻: 5 ページ: 1142-1148

    • DOI

      10.1242/bio.019349

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Rapid and efficient analysis of gene function using CRISPR-Cas9 in Xenopus tropicalis founders2016

    • 著者名/発表者名
      Shigeta M, Sakane Y, Iida M, Suzuki M, Kashiwagi K, Kashiwagi A, Fujii S, Yamamoto T and Suzuki KT
    • 雑誌名

      Genes to Cells

      巻: 21 ページ: 755-771

    • DOI

      10.1111/gtc.12379

    • 査読あり
  • [学会発表] ゲノム編集技術の基本原理 と医学研究での利用2017

    • 著者名/発表者名
      山本 卓
    • 学会等名
      第16回日本再生医療学会総会
    • 発表場所
      仙台
    • 年月日
      2017-03-07 – 2017-03-09
    • 招待講演
  • [学会発表] ゲノム編集の基本原理と医学分野での利用2016

    • 著者名/発表者名
      山本 卓
    • 学会等名
      第31回 日本整形外科学会基礎学術集会
    • 発表場所
      福岡
    • 年月日
      2016-10-10 – 2016-10-13
    • 招待講演
  • [学会発表] ゲノム編集の基本原理と最近の研究動向2016

    • 著者名/発表者名
      山本 卓
    • 学会等名
      日本学術会議公開学術講演会「ゲノム編集技術の技術と将来展望」
    • 発表場所
      東京
    • 年月日
      2016-08-19
    • 招待講演
  • [図書] ゲノム編集入門2016

    • 著者名/発表者名
      山本 卓
    • 総ページ数
      20
    • 出版者
      裳華房
  • [備考] 広島大学大学院理学研究科分子遺伝学研究室

    • URL

      http://www.mls.sci.hiroshima-u.ac.jp/smg/index.html

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公開日: 2018-01-16  

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