| 研究課題/領域番号 |
26291003
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
黒柳 秀人 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 准教授 (30323702)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 新生RNA / 線虫 / 組織特異性 / 転写後プロセシング |
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| 研究実績の概要 |
計画Aとして、TU-taggingによる線虫の生体における新生RNAの組織特異的な標識法と濃縮法の確立を目指していた。Ai)のT. gondii UPRTを組織特異的に発現するトランスジェニック線虫の作製について、体壁筋特異的プロモータと神経系特異的プロモータによるT. gondii UPRT発現ベクターを染色体外アレイとして持つトランスジェニック線虫の作製までは順調に進んだ。その後の段階である紫外線照射によるトランスジーンの染色体への組み込みについては、通常の数倍の数のスクリーニングを行ったにもかかわらず、これまでのところ安定なトランスジェニック株を得られていない。
計画Cとして、Aで得たトランスジェニック線虫を用いて、4-チオウラシル（4TU）によって代謝標識した新生RNAの経時変化の追跡を計画していた。計画どおりトランスジェニック線虫が得られないことから、代替として哺乳類培養細胞にT. gondii UPRTをトランスフェクションにより発現させ、4TUによって新生RNAを代謝標識し精製する過程を試みた。その結果、T. gondii UPRT依存的に新生RNAを4TU標識し、ビオチン化して精製するまでの実験系を確立し、標識時間の違いにより新生RNAのプロセシングパターンが変化する様子も観察した。
計画Dとして、抗LST-3抗体によるChIP-seqを計画していたが、定量PCRによるクロマチン免疫沈降の確認まで進んでいる。今後、並行して行っている抗リン酸化RNAポリメラーゼII抗体でクロマチン免疫沈降の特異性の確認を経たうえで、大規模シーケンス解析に回す予定である。
計画EとしてLST-3と免疫共沈するタンパク質の同定を計画していた。これまでに野生型とlst-3変異体についてChIPと同じ条件でホルムアルデヒド固定した核を大量に調製し、可溶化後に免疫沈降するところまで進んだ。今後、質量分析によるタンパク質の同定を予定している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
計画Ai)のT. gondii UPRTを組織特異的に発現するトランスジェニック線虫の作製について、トランスジーンを染色体へ組み込んだ安定発現株の作製に想定外の時間を要し、現在まで達成されていない。T. gondii UPRTの高発現株が毒性を持つ可能性が考えられるため、トランスジーンの量を減らす計画である。Ai)の完了が前提となっているAii)の線虫個体におけるRNAの組織特異的な4TU標識と計画Bの組織特異的poly(A) RNAの解析についても予定どおりには進行していない。
計画Cについて、Aで得たトランスジェニック線虫を用いて実験をする計画であったが、線虫株が得られていないため、予定どおりには進行していない。代替として哺乳類培養細胞を用いて実験系を確立した。標識時間を変えることで新生RNAの経時的な変化を追跡できることも確認できた。Aで線虫T. gondii UPRT安定発現株が得られたら、同様に線虫の個体レベルで新生RNAの標識の確認と経時変化の追跡を行う予定である。
計画Dとして、抗LST-3抗体によるクロマチン免疫沈降で得たDNAを大規模シーケンス解析に回す予定であったが、その試料調製を終えた段階に留まっており、やや遅れている。予備実験での定量PCRに用いるプライマーセットの確立に時間を要した。
計画EとしてLST-3と免疫共沈するタンパク質の同定については、質量分析によるタンパク質の同定まで進む予定であったが、試料調製と特異的な免疫沈降の確認までは終えており、やや遅れている。出発材料となる大量の核を調製するための線虫の液体培養とそのためのエサの調製に半年以上の時間を要した。
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| 今後の研究の推進方策 |
計画Aについては、引き続き安定発現株が得られるよう努める。トランスジーンマーカーの工夫とCRISPR/Cas9系を用いた発現ベクターの直接組み込み系の構築の２とおりの解決策を計画している。
組織特異的なpoly(A)+ RNAの解析を目指す計画Bについては、Aのトランスジェニック線虫株が完成して予備的な確認を行えば技術的には実現可能になる見込みで、Aが完了次第実施する。
計画Cについては、計画Aが完了次第実施する。4TUによる新生RNAの生体内での標識と細胞分画法とも組み合わせて、組織特異的かつ細胞画分特異的な新生RNAの調製についても試みる。
計画Dについては、ChIP-qPCRによりクロマチン免疫沈降の特異性が確認でき次第、ChIP-DNAの大規模シーケンス解析へ進む。抗リン酸化RNAポリメラーゼII抗体によるクロマチン免疫沈降も並行して行っており、これらの抗体によるChIPの結果を生物情報学的に比較し、LST-3の機能についての仮説を得る。
計画Eについては、抗LST-3抗体で共沈したタンパク質の同定を行う。興味深いタンパク質が同定されたら、内在性のそのタンパク質に対する抗体を作製して、LST-3依存的な共沈の確認を行う。また、その抗体を利用した細胞内局在の確認やクロマチン免疫沈降の可否を検討する。同定したタンパク質の遺伝子のノックダウン実験またはノックアウト株の作製により、転写と転写後プロセシングについての表現型の解析し、LST-3の機能との相関を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
全体として研究計画に遅れている部分があり、特に、高額の試薬代や委託料を予定していた計画B、C、Dの大規模シーケンス解析（RNAseqとChIPseq）および計画Eの質量分析によるタンパク質の同定の段階に進まなかったことが、平成26年度の使用額が予定を大きく下回った理由となっている。
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| 次年度使用額の使用計画 |
計画Dのクロマチン免疫沈降については、すでに試料調製までは済んでおり、定量PCRによる特異性の確認の後に、大規模シーケンス解析に進む予定である。
計画Eの質量分析についても、分析用試料の調製まではできており、最初の質量分析に進む予定である。その結果を受けて、今後の試料調製の方法や投入する出発材料の量について検討を行う。
計画Aのトランスジェニック線虫株の作製については現在も進行中であるが、株が作製できれば、計画B, Cの大規模シーケンス解析を行って所期の計画どおり研究費を消化する見込みである。
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