研究課題
本研究では、以下の2課題に取り組んだ。課題1：in vitro転写系と損傷導入プラスミドを用いて、RNA polIIoのDNA損傷個所での停止と、その後のユビキチン化分子反応を解析するシステムを構築した。UVSSAやCS複合体、E3リガーゼ関連因子の各反応ステップにおける要求性について、詳細に調査する。さらに、各因子の機能性ミュータントの解析を実施することで、分子相互の依存関係、作用機序の解明に取り組む。課題2：RNA polIIoをユビキチン化するE3リガーゼ複合体について、リコンビナント蛋白質の共結晶化とX線結晶構造解析を実施中である。RNA polIIoのユビキチン化反応が、UVSSAとE3複合体のどのような作動原理に基づいて生じるのかを構造生物学的に明らかにする。また、構造解析の結果に基づいた機能性ミュータントを作成し、生化学的/細胞生物学的解析を行い、課題1と併せて分子間相互作用機序を明らかにする。初年度は、紫外線誘発型のDNA損傷を導入したプラスミドテンプレートの作成が完了し、in vitro転写系の構築が順調に進んだ。また、DNA修復活性が欠損、あるいはユビキチン化能が欠損したUVSSAのミュータントを追加同定した。今後、これらのミュータントとin vitro転写系を用いて、RNA polIIoユビキチン化反応の詳細を解明していく。さらに、これまで精製困難であったUVSSA蛋白質を、比較的簡単に精製する技術を確立した。ことから、今後、大量精製を進め、結晶構造解析を実施する。
2: おおむね順調に進展している
in vitro転写系の構築に取り組み、完成目前であること、精製困難であったUVSSA蛋白質を比較的簡便に大量精製する条件・方法を確立したこと等から、本研究は順調に進んでいると考えられる。
in vitro転写系を完成させ、損傷依存的なRNA polIIoのユビキチン化反応の詳細を明らかにする。また、結晶化に向けたリコンビナント蛋白質の大量精製を実施し、結晶構造解析を進める
本年度は、in vitro転写系の構築・標的蛋白質の精製系の改良を行ったが、これらが比較的安価に実施できた事から、予定していた研究費を次年度に繰り越し、これらの構築・改良した技術を用いて解析するための消耗品費として、使用する事とした。
構築間近のin vitro転写系を完成させ、これを用いて、詳細なRNA polIIoのユビキチン化反応の調査を行うための消耗品費として使用する予定である。また、改良した精製技術を利用して、標的蛋白質の大量精製を実施し、結晶構造解析に取り組むための、消耗品費用に充てる予定である。
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すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件) 学会発表 (12件) (うち招待講演 2件) 備考 (1件)
Nature Protocols
巻: 10 ページ: 12-24
10.1038/nprot.2014.194.
Journal of Clinical Investigation
巻: 124 ページ: 3137-3146
10.1172/JCI74593.
http://www.nrgic.prj.nagasaki-u.ac.jp/
