| 研究課題/領域番号 |
26291008
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
田中 良和 北海道大学, 先端生命科学研究科(研究院), 准教授 (20374225)
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| 研究分担者 |
姚 閔 北海道大学, 先端生命科学研究科(研究院), 教授 (40311518)
加藤 公児 北海道大学, 先端生命科学研究科(研究院), 助教 (30452428)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | X線結晶解析 / 軟体動物 / 巨大分子 / ヘモシアニン |
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| 研究実績の概要 |
イカなどの軟体動物は，酸素運搬という生命活動の根幹を担う機構を，ヘモシアニンという分子量約4MDaの巨大蛋白質会合体を用いて行っている．本研究は，その大きさゆえにこれまで低分解能でしか捉えられていなかった，この巨大蛋白質会合体の立体構造をX線結晶構造解析により原子分解能で解明し，その分子機構を詳細に記述する．
平成26年度は，活きたスルメイカから採取したヘモシアニンを用いて結晶を調製し，X線回折実験を行った．また，結晶の吸収スペクトルをSPring-8 BL38B1にて測定したところ，345nm付近に大きな吸収が確認された事から，この結晶は酸素結合型の分子の結晶である事がわかった．Photon Factory BL5Aにて3.0Åの分解能のX線回折データセットを収集し，電子顕微鏡により得られている貝由来ヘモシアニンのCαモデルをサーチモデルに用いた分子置換法で構造を決定した．アミノ酸配列情報は，スルメイカゲノムからPCRにより増幅したスルメイカ遺伝子から決定した．明らかになった構造は，4MDaの10量体のヘモシアニンであり，筒状の構造をしていた．外側の壁領域と，内部のえり領域から構成されており，80個の類似した構造のFunctional unit (FU)が階層的に会合して分子全体が形成されていた．各FUは隣接するFUと分子内のFU2量体を形成し，それらが高度に会合する事で壁領域が構築されていた．一方，内部のえり領域は，分子間のFU2量体が形成されており，これらの構造的特徴から，巨大なヘモシアニンの全体が，FU2量体を構成要素として構築されている事が明らかになった．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成26年度は，酸素結合型ヘモシアニンの原子構造を決定することに成功し，そのアーキテクチャーの詳細を明らかにした．また，糖鎖修飾が会合に及ぼす影響についても有用な知見を得た．以上の結果より，おおむね順調に進展していると判断した．
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| 今後の研究の推進方策 |
平成27年度は，脱酸素形ヘモシアニンの結晶化・構造解析を行う．また，各FUの発現系を構築し，銅がどのように活性中心に取り込まれるのかを明らかにする．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成26年度に，試薬や実験器具類の購入について検討し節約に努めた結果，2,700,000円の使用残高が生じたが，これを平成27年度に実施予定であるヘモシアニンの構造解析のための消耗品購入に充てる．なお，本年度，蛋白質精製用の消耗品費として使用した255,779円（本年度内に納品完了済）の支払い処理が平成27年度以降となった．
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成27年度の研究費630万円のうち，結晶化用試薬類，蛋白質精製用カラムなどの消耗品費に315万円，大型放射光施設での回折データ収集や学会参加等の旅費として100万円，研究補助員人件費として120万円，その他，糖鎖解析や英文校正料，研究成果論文投稿料として95万円を計上する．
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