| 研究課題/領域番号 |
26291009
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| 研究機関 | 千葉大学 |
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研究代表者 |
村田 武士 千葉大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (80415322)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | V-ATPase / 分子モーター / 構造解析 |
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| 研究実績の概要 |
１:AサブユニットのX線結晶構造解析---前年度は、ソーキング法によりAMP-PNP結合型のAサブユニットの結晶構造解析を進めたが、得られた構造にはAMP-PNPが結合していなかった。本年度は、最適条件下で過剰量のAMP-PNPと精製したAサブユニットを混合し、共結晶化のスクリーニングを行った。いくつかの条件で良質の結晶が得られ、X線結晶構造解析を行った。得られた結晶構造はヌクレオチド非結合型と同型であり、AMP-PNPに相当する電子密度は見つからなかった。次年度はADPとAサブユニットとの共結晶構造解析を進める。
２:BサブユニットのX線結晶構造解析---前年度の研究により、Bサブユニット結晶のデータ収集に成功し、分子置換法により位相決定に成功した。本年度は、X線結晶構造解析を継続し、Bサブユニットの結晶構造を3.5 A分解能で決定した。
３:A1B1複合体のX線結晶構造解析---前年度の研究により、A1B1複合体と予想されるサンプルの結晶を得ることに成功した。本年度は、X線結晶構造解析を継続し、3.1 A分解能で結晶構造を決定した。得られた構造には３つのAMP-PNPが結合した擬似的なA3B3複合体を形成していたが、N末のバレルリングが崩壊していた。今後は、得られた結晶構造から示唆される構造形成と機能制御の分子機構を考察する。
４:変異A3B3複合体の作製及び機能構造解析---前年度の研究により、A3B3複合体の構造形成に重要と考えられるBサブユニットのアルギニンフィンガーと呼ばれる残基（R350）に関して、部位特異的変異導入を行い、３種類の変異体を大量に精製した。本年度は、これら３種類の変異体の結晶化スクリーニングを行った。このうち、変異体R350Rの結晶を得ることに成功した。今後は、X線結晶構造解析を継続する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初計画通り、ヌクレオチド非結合型Aサブユニットの結晶構造の決定、Bサブユニットの結晶構造の決定、A1B1の結晶構造の決定、A3B3変異体の結晶化に成功している。このため予定通り順調に進展していると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初計画に従って、各研究項目を継続する。AMP-PNPのソーキング及び共結晶化で得ることが難しかったヌクレオチド結合型Aサブユニットについては、ADPとの共結晶化を試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初計画では水谷健二博士の雇用を予定していたが、本研究費が減額となり、年間を通じた雇用ができなかった。その代わりに鈴木花野博士の人件費として使用したため使用額が変わり、次年度使用額が生じた。これによる研究の遅れは生じなかった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度も引き続き、鈴木花野博士の人件費として使用する予定である。
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