RNAサイレンシングの分子機構の解明

2015 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 26291010
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 西増 弘志 東京大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (00467044)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 結晶構造

研究実績の概要

細菌Staphylococcus aureusに由来する小型のCas9（SaCas9）、sgRNA、（5’-TTGAAT-3’ PAM、5’-TTGGGT-3’ PAM）を含む標的DNAからなる複合体の結晶構造を決定し、SaCas9-sgRNAによるDNA認識機構を解明した。構造情報をもとにSaCas9を改変し、新規の転写活性化ツールおよび誘導型ヌクレアーゼを作製した。細菌Francisella novicidaに由来する大型のCas9（FnCas9）の構造機能研究を行った。機能解析の結果、FnCas9は5’-NGG-3’という塩基配列をPAMとして認識することが明らかになった。FnCas9、sgRNA、（5’-TGG-3’ PAM、5’-TGA-3’ PAM）を含む標的DNAからなる複合体の結晶構造を決定し、FnCas9-sgRNAによるDNA認識機構を解明した。構造情報をもとに5’-YG-3’ PAMを認識するFnCas9改変体を作製した。FnCas9-sgRNA RNPをマウス受精卵に注入することにより5’-YG-3’ PAMをもつ標的配列のゲノム編集に成功した。3種類のSpCas9改変体の結晶構造を決定し、それらのPAM認識機構を解明した。野生型SpCas9との比較から、アミノ酸置換により標的2本鎖DNAの構造変化が引き起こされPAM認識が改変されていることが明らかになった。SpCas9、SaCas9、FnCas9の構造を比較することにより、CRISPR-Cas9系における保存性および多様性が明らかになった。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

SaCas9、FnCas9の結晶構造をCell誌に発表し、SpCas9改変体の結晶構造をMol Cell誌に発表したため。

今後の研究の推進方策

piRNA経路の中核因子であるPIWIに関して結晶構造解析を進める。

次年度使用額が生じた理由

Cas9オルソログの結晶構造決定を目指したが、適切なタイミングで放射光施設ビームタイムを確保できなかったため、それらの実験をH28年度に延ばす必要があったため。

次年度使用額の使用計画

物品費（タンパク質調製、結晶化試薬）として使用する。

研究成果

• [国際共同研究] Broad Institute of MIT and Harvard(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: Broad Institute of MIT and Harvard
• [雑誌論文] Structure and Engineering of Francisella novicida Cas9 (2016)
  • 著者名/発表者名: Hisato Hirano, Jonathan S. Gootenberg, Takuro Horii, Omar O. Abudayyeh, Mika Kimura, Takanori Nakane, Ryuichiro Ishitani, Izuho Hatada, Feng Zhang, Hiroshi Nishimasu, Osamu Nureki
  • 雑誌名: Cell 巻: 164 ページ: 950-961
  • DOI: 10.1016/j.cell.2016.01.039
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Structural Basis for the Altered PAM Specificities of Engineered CRISPR-Cas9 (2016)
  • 著者名/発表者名: Seiichi Hirano, Hiroshi Nishimasu, Ryuichiro Ishitani, Osamu Nureki
  • 雑誌名: Molecular Cell 巻: 61 ページ: 886-894
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2016.02.018
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Crystal Structure of Staphylococcus aureus Cas9 (2015)
  • 著者名/発表者名: Hiroshi Nishimasu, Le Cong, Winston X. Yan, F. Ann Ran, Bernd Zetsche, Yinqing Li, Arisa Kurabayashi, Ryuichiro Ishitani, Feng Zhang, Osamu Nureki
  • 雑誌名: Cell 巻: 162 ページ: 1113-1126
  • DOI: 10.1016/j.cell.2015.08.007
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [学会発表] 小型CRISPR-Cas9の結晶構造 (2015)
  • 著者名/発表者名: 西増弘志、石谷隆一郎、濡木 理
  • 学会等名: BMB2015
  • 発表場所: 神戸国際会議場（兵庫県神戸市）
  • 年月日: 2015-12-03 – 2015-12-03
• [学会発表] CRISPR-Cas9の結晶構造 (2015)
  • 著者名/発表者名: 西増弘志
  • 学会等名: 第53回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: 金沢大学（石川県金沢市）
  • 年月日: 2015-09-15 – 2015-09-15
  • 招待講演
• [備考] ゲノム編集のための「小さなはさみ」のかたち
  • URL: http://www.s.u-tokyo.ac.jp/ja/press/2015/36.html
• [備考] ゲノム編集のための新たな「はさみ」-立体構造にもとづくCRISPR-Cas9の改変-
  • URL: https://www.s.u-tokyo.ac.jp/ja/press/2016/4599/