マイクロ流路超高速パルスラベルNMR装置の開発及びプリオン自己複製過程の解明

2015 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 26291011
• 研究機関: 岐阜大学
• 研究代表者: 桑田 一夫 岐阜大学, 大学院連合創薬医療情報研究科, 教授 (00170142)
• 研究分担者: 鎌足 雄司 岐阜大学, 学内共同利用施設等, 助教 (70342772)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: NMR / 混合器 / パルスラベル / プリオン / 自己複製

研究実績の概要

カイネッテックNMR、及びカイネティックCDを用い、リコンビナントプリオンタンパク質の構造崩壊過程の観測、及びその崩壊を抑制する低分子化合物であるメディカルシャペロンの作用機構の解明に成功した。構造崩壊過程はB‐へリックスとC‐へリックスの中間にあるループ領域から生ずることが分かったが、メディカルシャペロンは、そのループ領域に結合することにより、崩壊を抑制することが分かった（論文投稿中）。また、リコンビナントプリオンタンパク質の酸性領域で生ずる中間体を"A型"と命名し、その特徴づけを行った。A型では、へリックスBとCは、部分的に保たれているが、S1へリックスA、及びS2に至る領域において、立体構造がランダムになっていることが分かった。さらにA型がフォールディングと凝集体形成の分岐点となることもわかった(Honda eｔ aｌ., Sｔrucｔure 2015)。高速混合をNMRマグネット内で行うために、既存のMICCS装置を使用し、低分子の混合を行った。しかし、混合の不完全性による局所磁化率の変動などの不均一性に起因すると思われる複数のピークが観測された。今後、磁場の均一性を保持することが可能な、新たな混合装置を製作する計画である。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

独自に開発したカイネッテックNMR、及びCDを用い、これまでプリオン立体構造の進化過程を原子分解能で観測してきた結果、初期に崩壊する部位が明らかになり、この崩壊を抑制することにより、プリオンの異常化を抑制できることが明らかとなった。本研究では、新規に「マイクロ流路超高速パルスラベルNMR装置」を開発し、これらの特異的分子間相互作用を速度論的にアミノ酸レベルで解析し、自己複製のメカニズムを原子レベル解明すること目的とするものである。本年度、「MICCS装置」をカイネッテックNMRに直接接続したが、磁場の不均一性に起因するアーチファクトを複数観測した。本測定に関わる設計上の問題点、及び改良点が明らかとなり、次年度の混合装置の設計・製作法、及び実験計画が立案できたため、達成度を(2)と判断した。

今後の研究の推進方策

NMRに用いる5ｍφのガラスチューブ内に新規混合器を作成し、プリオン進化過程の観測を行う。まず、大腸菌で発現・精製したリコピンビナント正常型プリオンに対し、プレ凝集状態を作成する。プレ凝集状態は、異常型へ進化するときの前駆状態と考えられるが、キネティックNMRを用いた実験から、プリオンのBCループ(ポリT付近)付近の構造がまず変化することがわかっている。次年度は、新規に作成した混合器を用いてNMR観測を行い、プリオンの進化の過程において、どの原子の座標が先に変化するのか、またその順序やタイムスケールの問題はどうかなど、世界で誰も見たことがない現象を観測し、プリオン進化の本質を捉える計画である。

研究成果

• [雑誌論文] Synthesis of double-fluorescent labeled prion protein for FRET analysis (2015)
  • 著者名/発表者名: Hosokawa-Muto J, Yamaguchi KI, Kamatari YO, Kuwata K
  • 雑誌名: Biosci Biotechnol Biochem. 巻: 79(11): ページ: 1802-1809
  • DOI: 10.1080/09168451.2015.1050991
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Cryogenic coherent X-ray diffraction imaging biological non-crystalline particles using the KOTOBUKI-1 diffraction apparatus at SACLA (2015)
  • 著者名/発表者名: Oroguchi Tomotaka, Sekiguchi Yuki, Kobayashi Amane, Masaki Yu, Fukuda Asahi, Hashimoto Saki, Nakasako Masayoshi, Ichikawa Yuichi, Kurumizaka Hitoshi, Shimizu Mitsuhiro, Inui Yayoi, Matsunaga Sachihiro, Kato Takayuki, Namba Keiichi, Yamaguchi Keiichi, Kuwata Kazuo, Kameda Hiroshi, Fukui Naoya,
  • 雑誌名: J. Phys. B. 巻: 48(18) ページ: 18400-18403
  • DOI: 10.1063/1,4822123
  • 査読あり
• [雑誌論文] A native-like intermediate serves as a branching point between the folding and aggregation pathways of the mouse prion protein (2015)
  • 著者名/発表者名: Honda RP, Xu M, Yamaguchi KI, Roder H, Kuwata K
  • 雑誌名: Structure. 巻: 23(9) ページ: 1735-1742
  • DOI: 10.1016/j.str.2015.07.001
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Logical design of anti-prion agents using NAGARA (2015)
  • 著者名/発表者名: Ma B, Yamaguchi K, Fukuoka M, Kuwata K
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun. 巻: 469(4): ページ: 930-935
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2015.12.106
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] 研究と臨床をつなぐ―プリオン病治療薬開発における基礎から前臨床まで― (2015)
  • 著者名/発表者名: 桑田一夫
  • 雑誌名: 医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス 巻: Vol.46 No.7 ページ: 428-432
  • 査読あり
• [雑誌論文] 神経変性疾患と‘かたち’の制御 (2015)
  • 著者名/発表者名: 桑田一夫
  • 雑誌名: Clinical Neuroscience月刊 臨床神経科学 言語の起源と脳の進化 Vol.33 8 962-963 巻: Vol.33 8 ページ: 962-963
  • 査読あり
• [学会発表] プリオン病治療薬の開発 (2016)
  • 著者名/発表者名: 桑田一夫
  • 学会等名: 第5回岐阜構造生物学・医学・論理的創薬研究シンポジウム
  • 発表場所: 岐阜薬科大学、岐阜
  • 年月日: 2016-03-10 – 2016-03-10
  • 招待講演
• [学会発表] Toward a first in human trial of a medical chaperone for prion diseases（オーラル） (2015)
  • 著者名/発表者名: Kazuo Kuwata
  • 学会等名: Therapeutic approaches to prion disease and other neurodegenerative conditions associated with protein misfolding
  • 発表場所: Cold Spring Harbor Laboratory, USA
  • 年月日: 2015-09-15 – 2015-09-18
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Continuous ultrasonication induces the rapid formation of mPrP aggregates（ポスター） (2015)
  • 著者名/発表者名: Kei-ichi Yamaguchi, Ryo P. Honda, Abdelazim Elsayed Elhelaly, Kazuo Kuwata
  • 学会等名: APPS2015
  • 発表場所: 石川音楽堂、石川県
  • 年月日: 2015-09-04 – 2015-09-05
  • 国際学会
• [学会発表] ’A-state’ of PrP a branching point between the folding and misfolding pathways（ポスター） (2015)
  • 著者名/発表者名: Ryo P. Honda, Kazuo Kuwata
  • 学会等名: APPS2015
  • 発表場所: 石川音楽堂、石川県
  • 年月日: 2015-09-04 – 2015-09-05
  • 国際学会
• [学会発表] Strategy for elucidating abnormal structure od prion proteins using the double-fluorescent labeling method and FRET analysis（ポスター） (2015)
  • 著者名/発表者名: Yuji O.Kamatari, Junji Hosokawa-Muto, Kei-ichi Yamaguchi, Kazuo Kuwata
  • 学会等名: APPS2015
  • 発表場所: 石川音楽堂、石川県
  • 年月日: 2015-09-04 – 2015-09-05
  • 国際学会
• [学会発表] Structural Characterization of Two Distinct Yeast Prion Protein Interaction（オーラル） (2015)
  • 著者名/発表者名: Toshinobu Shida, Yuji Kamatari, Yoshiki Yamagushi, Kazuo Kuwata, Motomasa Tanaka
  • 学会等名: 第15回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: あわぎんホール、徳島県
  • 年月日: 2015-06-24 – 2015-06-26
  • 招待講演
• [学会発表] Molten globule state and misfolding of a prion protein（オーラル） (2015)
  • 著者名/発表者名: Kei-ichi Yamaguchi, Ryo P. Honda, Kazuo Kuwata
  • 学会等名: 第15回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: あわぎんホール、徳島県
  • 年月日: 2015-06-24 – 2015-06-26
  • 招待講演
• [学会発表] Elucidation of the pathogenic conversion mechanism of a prion protein, diagnosis and treatment（オーラル） (2015)
  • 著者名/発表者名: Kazuo Kuwata
  • 学会等名: 第15回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: あわぎんホール、徳島県
  • 年月日: 2015-06-24 – 2015-06-26
  • 招待講演
• [学会発表] Toward the First in Human Clinical Trial of Medical Chaperone for Prion Diseases（オーラル） (2015)
  • 著者名/発表者名: 桑田一夫
  • 学会等名: 第56回日本神経学会学術大会
  • 発表場所: 朱鷺メッセ、ホテル日航新潟、新潟県
  • 年月日: 2015-05-20 – 2015-05-23
  • 招待講演