| 研究課題/領域番号 |
26291012
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
三木 邦夫 京都大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (10116105)
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| 研究分担者 |
渡部 聡 東北大学, 多元物質科学研究所, 助教 (50432357)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 構造生物学 / 成熟化タンパク質 / Ｘ線結晶解析 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は，[NiFe]ヒドロゲナーゼの成熟化過程で過渡的に形成されるHypタンパク質複合体などを中心に構造解析を行い，成熟化過程の分子機構を明らかにすることを目的としている．
HypAB複合体のSECカラムを用いた結合実験によって，ATPγS存在下で両者が複合体を形成することが分かった．この結果を基に複合体サンプルを調製し，1.7 A 分解能での結晶構造を決定することができた．HypAB複合体は，HypA二分子HypB二分子のヘテロ四量体を形成していた．HypBと複合体を形成することで，HypAは大きく構造変化しており，HypAのHis98がN末端に接近していた．その結果，単独のHypAには存在しなかったNi結合部位がN末端に形成されており，その部位にNiが結合していることも確認できた．等温滴定型熱量測定により，HypAは複合体を形成することで，Niに対する親和性が約600倍上昇することが分かった．
HyhL-HypA複合体については，結晶化条件やクライオ条件の最適化を行い，3.7 A 分解能の回折強度データを収集することができた．さらに分解能の向上を目指している．
Thermococcus kodakarensisの菌体抽出液から，Ni供給タンパク質としての候補タンパク質を探索した．Strepタグ付きHypBを作成し，菌体抽出液とHypBおよびHypAB複合体との反応サンプルをタグ精製することによって，HypB（HypAB複合体）と結合するタンパク質を検索した．
HybD（申請書のHycIより名称変更）の大腸菌を用いた大量発現系を構築し，精製方法を確立した．HybD単独の結晶構造を1.8 A 分解能で決定することに成功し，決定された構造から金属結合部位を予想した．並行して，HyhL-HybD複合体の結晶化も行った．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
HypAB複合体の構造を 1.7A 分解能で決定することができ，Ni結合部位を特定することができた．また，明らかにした構造を基に生化学的解析にも取り組み，HypAB複合体がNiを捉えるメカニズムを解明した．HyhL-HypA複合体については，3.7 A 分解能のフルデータを収集することができた．HybDについても，1.8 A 分解能で構造を決定することができた．
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| 今後の研究の推進方策 |
HyhL-HypA複合体については，引き続き結晶化条件や測定条件の検討を行い，より高分解能なデータ収集を目指す．他のHypタンパク質複合体についても，その調製・結晶化ならびに構造解析に取り組む．引き続きNi供給タンパク質の候補タンパク質を検索する．HypAを用いた結合実験や，ゲノム情報を用いたNi結合モチーフの検索にも取り組む．HybD-HyhL複合体については，HyhLのC末端ペプチドを用いることも含めて，引き続き結晶化条件を検索する．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究での基幹的な要素である放射光利用によるＸ線回折の実験において，放射光施設の運転時間削減によって本年度の最終３か月間の実験が不可能になった．そのため，本年度はタンパク質試料の調製に専念し，その結晶化の一部は次年度に行うこととした．
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度の放射光Ｘ線回折実験の機会に合わせて，すでに調製したタンパク質の結晶化を行い，Ｘ線回折実験を実行する．また，より新鮮なタンパク質試料を得るため，その調製も併せて行う．タンパク質の調製ならびに結晶化，そのＸ線結晶構造解析に必要な経費に使用する計画である．
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