| 研究課題/領域番号 |
26291025
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| 研究機関 | 兵庫県立大学 |
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研究代表者 |
西谷 秀男 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 教授 (40253455)
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| 研究分担者 |
塩見 泰史 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 助教 (80380567)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 核酸 / 複製 / タンパク質 / 分解 |
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| 研究実績の概要 |
遺伝情報を正しく受け継ぐため、染色体の複製は細胞周期に一度だけ正確に行なわれる。CRL4-Cdt2 によるユビキチン化を介した分解系は、クロマチン上に装着（ロード）されたPCNA に依存して、ライセンス化因子Cdt1 をはじめとする特定の因子をS期に（およびDNA損傷後においても）迅速に選別的に分解する。その機構の解明のため研究を行った。
１、ヒトCdt2は酵母Cdt2に比べて３００アミノ酸におよぶ長いC末領域を有す。ヒトCdt2を、酵母Cdt2に対応するN末とC末の２つに分けて解析するため細胞内で発現する安定株を得た。N末だけでは、PCNA fociへのリクルートが低下していた。一方、C末はリクルートが見られた。C末領域の末端に見いだしたPCNA結合配列（PIP-ボックスという）に変異を入れるとPCNAへのリクルートが低下したので、この配列が複製部位への集積に重要であると考えた。しかし、C末は、本体のCRL4の構成要旨DDB1との結合が無く、ユビキチン化活性を有していなかった。また、Cdt2はS期でおいて高度にリン酸化される。これは、主にC末で起こることが、バンドシフトより認められた。
２、PCNAがDNA上にロードされた時のみCRL4-Cdt2が作動することを解析するため、in vitroでの解析を進めた。ssDNAにビオチン化したオリゴDNAを結合させたものを基に、DNAビーズを作成した。ニックを導入してPCNAローディング部位を作成し、精製したPCNAとRFC1-RFCを用いて、PCNAのローディング系の確立に成功した。ここに精製した基質Cdt1タンパク質を加えてプルダウン後、Cdt1が、一緒に共沈することを確かめた。PCNAが無いときは、結合は見られなかった。CRL4-Cdt2でも同様の結果が得られた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
CRL4-Cdt2によるタンパク質分解機構の解析を、細胞レベルでの機能解析と精製したタンパク質を用いた解析の２つのシステムで進めている。研究実績の概要に記述したように、１）、WD40リピートを７回もつN末は、基質認識部位を形成すると考えられているが、長いC末領域がPCNAと結合するなどしてユビキチン化において積極的な働きをしていることを見いだしつつ有る。また、２）、in vitro系を立ち上げ、PCNAをDNAにロードするシステムを構築し、基質Cdt1とユビキチンリガーゼCRL4-Cdt2のPCNA上への集積機構を解析できるようになり、次のステップへ進めることができる。よって、研究は、おおむね順調ん進行していると判断される。
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| 今後の研究の推進方策 |
１、ヒトCdt2は、酵母Cdt2に比べて長いC末領域を持っている。そのC末端にはPIPボックス配列が有り、PCNAとの結合に関わっていることを明らかにしている。Cdt2のC末の役割をさらに解析するため、C末全領域を欠失したCdt2-NとPIP-ボックスに変異を持つCdt2-PIPのユビキチン化活性を比較する。Cdt2-Nの方が、より一層ユビキチン化活性が低下しておれば、C末にはPIP-ボックス以外にさらに別の機能制御機構が考えられる。その一つにCdt2のリン酸化が考えられる。細胞周期のS期で働く主要なキナーゼはCDKである。このキナーゼのコンセンサス配列部位に変異を導入しその効果を調べる。
２、in vitro系において、これまでの研究成果により、DNAビーズを作製し、精製したPCNAおよびローダータンパク質RFC1-RFCを用いて、このDNA上にPCNAをロードする系を確立したので、この系を用いてCdt1およびCRL4-Cdt2の結合を調べる。Cdt1およびCRL4-Cdt2の精製法も確立している。Cdt1およびCRL4-Cdt2単独で加えた場合と、同時に加えた場合での違いの有無を検討する。また、DNAに結合したPCNAと結合していないPCNAを用いて、Cdt1およびCRL4-Cdt2の結合集積の違いを比較検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
大学からの講座費を旅費および試薬購入にあて当該研究にも利用することができたので、その分の研究費を一部次年度に使用することとなった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
翌年度の研究費と合わせて、研究の遂行に必要な物品費の購入のために適正に使用する。
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