水素原子レベルの時分割解析による呼吸鎖末端酸化酵素のプロトンポンプ機構の研究

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 26291033
• 研究機関: 兵庫県立大学
• 研究代表者: 吉川 信也 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 名誉教授 (40068119)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: チトクロム酸化酵素 / プロトンポンプ / ミトコンドリアエネルギー変換 / ヘムタンパク質 / 膜タンパク質 / 時分割Ｘ線構造解析 / 振動分光解析 / 電子構造生物学

研究実績の概要

O2還元過程の赤外/可視分光解析。文献記載のCaged O2化合物は全く予想外にも光感受性がかなり高いことが発見され、実験条件の再検討を開始した。一方フローフラッシュ法により完全（４電子）還元型によるO2還元過程の可視分光解析を行い、ほぼ文献値と矛盾のない結果を得た。低温（摂氏５度）に設定したため中間体の分離が良好であることが認められた。しかし、精度のさらなる向上が必要である。
時分割Ｘ線構造解析。静止Ｘ線回折データのみにもとづくＸ線構造解析法の開発とXFEL照射による周辺のＸ線損傷範囲の精密測定等を行い休止酸化型の無損傷Ｘ線構造を1.9オングストローム分解能で決定した。これはフェムト秒レベルの時分割Ｘ線構造解析が可能であることを示す歴史的成果と世界的に認められている。結晶中で反応を同期して開始させるレーザーフラッシュシステムをCO結合型チトクロム酸化酵素(CcO)結晶を標準として開発に成功した。そこでCO光解離後の時分割Ｘ線構造解析により赤外分光学的にとらえられている中間体のＸ線構造決定のため、常温でのＳＡＣＬＡでの時分割構造解析のための準備を開始した。CcO反応中間体の構造解析は順調に進展し、multiple conformerや分子内部のcarboxyl基のプロトン化状態がいくつかの残基で明らかになった。
チトクロムｃ/CcO相互作用解析。浸透圧の複合体形成への影響の解析にもとづいて結合に伴う脱離水分子数が見積もられた。複合体の二次元及び三次元元結晶化に成功し、チトクロムｃがプロトンポンプ機能制御に関与していることを示唆する結果を得た。これと関連して低酸素耐性因子であるHigD1aもプロトンポンプ機能を促進していることを示唆する結果を得た。また中性pHでの結晶化にも成功した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

文献記載のCaged O2化合物に光感受性が発見されたため実験条件の再検討が必要になっている。この課題は当初の計画よりやや遅れているが、これ以外はほぼ順調以上に進展している。特に休止酸化型CcOの無損傷構造の決定は、この構造の長年にわたる議論に終止符を打つだけではなくCcOのプロトンポンプ機構解明に大きく貢献する成果といえる。さらにこの成果はフェムト秒レベルの時間分解能の時分割Ｘ線構造解析が原理的に可能であることを証明するものであり、生命科学全体への大きな波及効果が期待できる（Nature Methodsに発表）。また、HigD1aのプロトンポンプ機能促進を示唆する結果（PNASに発表）は医学的、細胞生物学的重要性に加えて、HigD1aがプロトンポンプ機構の解明のための重要なprobeとして機能する可能性を示すものである。また、チトクロムｃ/CcO 複合体およびCcOの中性pHでの３次元結晶化の成功は、プロトンポンプにはチトクロムｃからの制御された電子伝達が不可欠であるので、プロトンポンプ機構解明に大きく貢献することが期待できる。これらはどれも当初計画以上に大きく進展した課題といえる。また、反応中間体の構造についても著しい分解能の向上があり酸化型については1.1オングストローム分解能の構造解析が開始された。またCO光解離後の時分割解析も種々の解決すべき問題点は発見されているが、本年度末のSACLAでの実験で精度は不十分ではあるがCO解離後20マイクロ秒のＸ線構造の予備的結果が得られている。これは時分割Ｘ線構造解析の世界最先端の成果といえる。これも当初計画より大きく進展した課題といえる。しかし、Caged O2を利用した反応追跡システムの開発が遅れているため、区分（２）を自己点検評価とした。

今後の研究の推進方策

O2還元過程の赤外/可視分光解析。結晶中のCcO反応の追跡に利用できる化学的性質を検証しつつCaged O2化合物の設計合成を継続する。フローフラッシュ法により完全還元還元型および部分（２電子）還元型CcOによるO2還元過程の赤外/可視分光解析を行う。Caged O2化合物による対照実験も行う。またCaged O2化合物を利用して結晶中での反応過程を追跡する。
時分割Ｘ線構造解析。初年度に開始したCO光解離後の時分割Ｘ線構造解析により赤外分光学的にとらえられている中間体のＸ線構造決定を目指す。この予備的結果に基づいてプロトン取り込み機構の理論的解析を開始する（。上述の結晶中での反応過程の赤外/可視分光解析結果に基づいて各反応中間体(P, F, O)の存在割合の最も高い時間の見積りを行い、その時間でのＸ線構造をXFELによる時分割解析を行う。静的状態でのP, F, O中間体のＸ線結晶構造解析をSPring-8を利用して水素原子レベルで決定する。
チトクロムc/CcO相互作用解析。TCS法によるCcOに直接関与するアミノ酸残基の同定、チトクロムcとCcOとの熱力学的解析を行う。また、チトクロムc/CcO複合体の２次元および３次元結晶構造解析により高分解能の構造を決定し、チトクロムｃによるプロトンポンプ制御機構を解明する。平行してHigD1a結合型の高分解能Ｘ線構造解析を行いその結果に基づいたプロトンポンプ機構の議論も行う。
中性子構造解析のための結晶化条件の探索。当面３オングストローム分解能を目標とする。
理論解析による評価をうけた上述の実験結果にもとづいてプロトンポンプ機構を演繹する。

研究成果

• [雑誌論文] Higd1a is a positive regulator of Cytochrome c Oxidase (2015)
  • 著者名/発表者名: Takaharu Hayashi , Yoshihiro Asano , Yasunori Shintani , Hiroshi Aoyama , Hidetaka Kioka , Osamu Tsukamoto , Masahide Hikita , Kyoko Shinzawa-Itoh , Kazuaki Takafuji , Takashi Ogura , Masafumi Kitakaze , Issei Komuro , Yasushi Sakata , Tomitake Tsukihara , Shinya Yoshikawa , Seiji Takashima, et al
  • 雑誌名: Proceedings of National Academy of Science, USA 巻: 112 ページ: 1553-1558
  • DOI: 10.1073/pnas.1419767112
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Reaction mechanism of cytochrome c oxidase (2015)
  • 著者名/発表者名: Yoshikawa, S., Shimada, A.
  • 雑誌名: Chem. Rev 巻: 112 ページ: 1936-1989
  • DOI: 10.1021/cr500266a
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] 膜タンパク質機能解析のための結晶構造解析戦略 (2015)
  • 著者名/発表者名: 吉川信也
  • 雑誌名: Ｄｏｊｉｎ Ｎｅｗｓ 巻: １５２ ページ: 7-15
  • 謝辞記載あり
• [雑誌論文] フェムト秒レーザー結晶構造解析法を用いた無損傷休止型チトクロム酸化酵素の構造解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 吉川信也
  • 雑誌名: Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 巻: ２８ ページ: ５６－６６
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Determination of damagefree crystal structure of an X-ray-sensitive protein using an XFEL (2014)
  • 著者名/発表者名: Hirata, K., Shinzawa-Itoh, K., Yano, N., Takemura, S., Kato. K., Hatanaka, M., Muramoto, K., Kawahara, T., Tsukihara, T., Yamashita, E., Tono, K., Ueno, G., Hikima, T., Murakami, H., Inubushi, Y., Yabashi, M., Ishikawa, T., Yamamoto, M., Ogura, T., Sugimoto, H., Shen, J.R., Yoshikawa, S., Ago, H
  • 雑誌名: Nature Methods 巻: 11 ページ: 734-736
  • DOI: 10.1038/NMETH.2962
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Proton Motive Force on the Structure and Dynamics of Bovine Cytochrome c Oxidase in Phospholipid Vesicles (2014)
  • 著者名/発表者名: Takashi Nomura, Sachiko Yanagisawa, Kyoko Shinzawa-Itoh, Shinya Yoshikawa, and Takashi Ogura
  • 雑誌名: Biochemistry 巻: 53 ページ: 6382-6391
  • DOI: 10.1021/bi501022j
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Improved X-ray structures of bovine heart cytochrome c oxidase reveal redox-driven proton active transports by Mg2+-containing water cluster (2014)
  • 著者名/発表者名: Shinya Yoshikawa, Naomine Yano, Kyoko Shinzawa-Itoh, Kazumasa Muramoto, Eiki Yamashita, Tomitake Tsukihara
  • 雑誌名: Biochimica et Biophysica Acta (BBA), Bioenergetics 巻: 1837 ページ: e103-e104
  • DOI: 10.1016/j.bbabio.2014.05.186
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] Proton pump mechanism of bovine heart cytochrome c oxidase (2015)
  • 著者名/発表者名: 吉川信也
  • 学会等名: 日本生物物理学会北海道支部講演会
  • 発表場所: 北大理学部(北海道・札幌市)
  • 年月日: 2015-03-04
  • 招待講演
• [学会発表] チトクロムc とチトクロム酸化酵素複合体のX 線結晶構造解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: Satoru Shimada, Kyoko Shinzawa-Itoh, Shimpei Aoe, Atsuhiro Shimada, Jumpei Baba, Syuhei Takemura, Eiki Yamashita, Tomitake Tsukihara, Shinya Yoshikawa
  • 学会等名: 第５２回日本生物物理学会
  • 発表場所: 札幌コンベンションセンター（北海道・札幌市）
  • 年月日: 2014-09-27
• [学会発表] ミトコンドリア呼吸鎖のシトクロムc-シトクロムc 酸化酵素複合体における 電子伝達反応の構造制御機構 (2014)
  • 著者名/発表者名: Mizue Imai1, Wataru Sato, Kaoru Inoue, Koichi Sakamoto, Kyoko Shinzawa, Takeshi Uchida, Shinya Yoshikawa, Koichiro Ishimori
  • 学会等名: 第５２回日本生物物理学会
  • 発表場所: 札幌コンベンションセンター（北海道・札幌市）
  • 年月日: 2014-09-26
• [学会発表] チトクローム酸化酵素の反応初期過程における共役機構の解明 (2014)
  • 著者名/発表者名: Satoru Nakashima, Minoru Kubo, Izumi Ishigami, Kyoko Itoh-Shinzawa, Shinya Yoshikawa, Takashi Ogura
  • 学会等名: 第５２回日本生物物理学会
  • 発表場所: 札幌コンベンションセンター（北海道・札幌市）
  • 年月日: 2014-09-26
• [学会発表] チトクロムc 酸化酵素の酸素還元反応の時間分解赤外吸収測定を目的とした酸素肺フローシステムの開発 (2014)
  • 著者名/発表者名: Tatsuhito Nishiguchi, Masahide Hikita, Kyoko Shinzawa-Itoh, Shinya Yoshikawa, Satoru Nakashima, Takashi Ogura
  • 学会等名: 第５２回日本生物物理学会
  • 発表場所: 札幌コンベンションセンター（北海道・札幌市）
  • 年月日: 2014-09-26
• [学会発表] アジ化物結合型チトクロム酸化酵素の高分解能 X 線結晶構造解析によるアジ化物結合様式の解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: Atsuhiro Shimada, Masahide Hikita, Hitomi Tadehara, Akima Yamamoto, Eiki Yamashita, Kyoko Shinzawa-Itoh, Tomoko Maeda, Tomitake Tsukihara, Shinya Yoshikawa
  • 学会等名: 第５２回日本生物物理学会
  • 発表場所: 札幌コンベンションセンター（北海道・札幌市）
  • 年月日: 2014-09-25
• [学会発表] 高度に組織化された鉄イオンの機能により駆動されるチトクロム酸化酵素反応機構 (2014)
  • 著者名/発表者名: 吉川信也、
  • 学会等名: 鉄バイオサイエンス学会第３８回学術集会
  • 発表場所: 仙台国際センター(宮城県・仙台市)
  • 年月日: 2014-09-06 – 2014-09-07
  • 招待講演
• [学会発表] Improved X-ray structures of bovine heart cytochrome c oxidase reveal redox-driven proton active transports by Mg2+-containing water cluster (2014)
  • 著者名/発表者名: Shinya Yoshikawa, Naomine Yano, Kyoko Shinzawa-Itoh, Kazumasa Muramoto, Eiki Yamashita, Tomitake Tsukihara
  • 学会等名: European Bioenrgetics Conference (EBEC)2014
  • 発表場所: Lisbon （Portugal）
  • 年月日: 2014-07-12 – 2014-07-17
• [学会発表] CO結合型ウシ心筋チトクロムc酸化酵素に対する高分解能Ｘ線結晶構造解析法を用いた金属酸化還元中心によるプロトンポンプ制御機構の解明 (2014)
  • 著者名/発表者名: 矢野直峰、武村秀平、前田友子、村本和優、山下栄樹、伊藤―新澤恭子、月原冨武、吉川信也
  • 学会等名: 第１４回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: ワークピア横浜/横浜産貿ホールマリネリア(神奈川県・横浜市)
  • 年月日: 2014-06-26
• [学会発表] Highly stable tubes of bovine mitochondrial F-ATP synthase suitable for electron cryo tomography (2014)
  • 著者名/発表者名: Chimari Jiko, Kyoko Shinzaw-Itoh, Shintaro Maeda, Karen Davies, Tomitake Tsukihara, Shinya Yoshikawa
  • 学会等名: 第１４回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: ワークピア横浜/横浜産貿ホールマリネリア(神奈川県・横浜市)
  • 年月日: 2014-06-26
• [学会発表] CN-結合型およびCN-結合部分還元型チトクロムc酸化酵素の高分解能Ｘ線結晶構造解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 川原貴子、長尾修平、島田敦広、矢野直峰、武村秀平、前田友子、村本和優、伊藤―新澤恭子、山下栄樹、月原冨武、吉川信也
  • 学会等名: 第１４回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: ワークピア横浜/横浜産貿ホールマリネリア(神奈川県・横浜市)
  • 年月日: 2014-06-26
• [図書] “Respiratory Conservation of Energy with Dioxygen: Cytochrome c Oxidase” Metals Ions in Life Sciences Vol. 15, Sustaining Life on Planet Earth: Metalloenzymes Mastering Dioxygen and Other Chewy Gases (2015)
  • 著者名/発表者名: Yoshikawa, S., Shimada, A., and Shinzawa-Itoh, K
  • 総ページ数: 329 (89-130
  • 出版者: Springer, Dordrecht
• [図書] “XFEL studies on bovine heart cytochrome c oxidase” ADVANCES IN PHOTOSYNTHESIS AND RESPIRATION Including Bioenergy and Related Processes (2015)
  • 著者名/発表者名: Yoshikawa, S
  • 総ページ数: 印刷中
  • 出版者: Springer, Dordrecht