水素原子レベルの時分割解析による呼吸鎖末端酸化酵素のプロトンポンプ機構の研究

2016 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 26291033
• 研究機関: 兵庫県立大学
• 研究代表者: 吉川 信也 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 名誉教授 (40068119)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 呼吸鎖末端酸化酵素 / プロトンポンプ / 膜タンパク質 / ヘムタンパク質 / 時分割X線構造解析

研究実績の概要

１．時分割解析によるチトクロム酸化酵素(CcO)プロトンポンプ機構の研究。CcOのプロトンポンプはheme aの正荷電とプロトンとの静電的反撥により駆動される。その方向性決定機構の解明のため、CO結合型CcOの光解離過程のX線自由電子レーザー設備(SACLA)を利用した時分割構造解析を行った。その結果、CuBに結合したO2がポンププロトン輸送経路を閉鎖して逆流を防ぐことが明らかにされた（Science Advance査読中）。またCcOのO2還元過程のCOOH基領域の時分割赤外分光解析法がほぼ確立された。
２．静止Ｘ線構造解析。分解能の向上により、プロトンポンプ経路に4当量のプロトン受容部位が認められた（JBC発表済）。２種のO2還元過程反応中間体のO2還元中心とプロトン輸送経路のＸ線構造を決定した。アジ化物結合型の高分解能Ｘ線構造解析により、プロトン輸送経路からのプロトンの流出によりheme aの電子親和性が低下することが明らかにされ、プロトンがheme aに駆動されていることが実験的に示された。1.35angstrom分解能の構造解析によりCOO基のプロトン化状態が決定された。また質量分析によりCcOへの不安定なリン酸化、アセチル化部位が多数発見された（PNAS発表済）。
３．Cytochrome c(Cyt.c)/CcO相互作用解析。Cyt.c/CcO複合体のＸ線構造解析により、両分子界面には多数の水分子が３層に固定されている新規な複合体形成様式が発見された(EMBO J発表済)。Cyt.c/CcO間電子伝達に及ぼすCyt.cのアミノ酸変異効果に基づいて界面のアミノ酸残基の結合の熱力学が理論的に解析された（JBC発表済）。
４．まとめ。以上の研究により、本酵素のプロトンポンプ機構を原子の挙動として（水素原子レベルで）とらえることが現実的研究課題と見做せる段階に到達した。

現在までの達成度 (段落)

28年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

28年度が最終年度であるため、記入しない。

次年度使用額が生じた理由

28年度が最終年度であるため、記入しない。

次年度使用額の使用計画

28年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [国際共同研究] Oxford大学化学科(英国)
  • 国名: 英国
  • 外国機関名: Oxford大学化学科
• [雑誌論文] Complex structure of cytochrome c-cytochrome c oxidase reveals a novel protein-protein interaction mode (2017)
  • 著者名/発表者名: Shimada S, Shinzawa-Itoh K, Baba J, Aoe S, Shimada A, Yamashita E, Kang J, Tateno M, Yoshikawa S, Tsukihara T
  • 雑誌名: EMBO J 巻: 36 ページ: 291-300
  • DOI: 10.15252/embj.201695021
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Two dimensional crystallization of monomeric cytochrome c oxidase with bound cytochrome c in reconstituted lipid membranes, (2016)
  • 著者名/発表者名: Osuda Y, Shinzawa-Itoh K, Maeda S, Yoshikawa S, Tsukihara, T, Gerle C
  • 雑誌名: Microscopy 巻: 65 ページ: 263-267
  • DOI: 10.1093/jmicro/dfv381
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Energetic Mechanism of Cytochrome c-Cytochrome c Oxidase Electron Transfer Complex Formation under Turnover Conditions Revealed by Mutational Effects and Docking Simulation, (2016)
  • 著者名/発表者名: Sato N, Hitaoka S, Inoue K, Imai M, Uchida T, Shinzawa-Itoh K, Yoshikawa S, Yoshizawa K, Ishimori K
  • 雑誌名: J. Biol. Chem 巻: 291 ページ: 15320-15331
  • DOI: 10.1074/jbc.M115.708065
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] The Mg2+-containing Water Cluster of Mammalian Cytochrome c Oxidase Collects Four Pumping Proton Equivalents in Each Catalytic Cycle (2016)
  • 著者名/発表者名: Yano N, Muramoto K, Shimada A, Takemura S, Baba J, Fujisawa H, Mochizuki M, Shinzawa-Itoh K, Yamashita E, Tsukihara T, Yoshikawa S.
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 巻: 291 ページ: 23882-23894
  • DOI: 10.1074/jbc.M115.711770
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Dimer interface of bovine cytochrome c oxidase is influenced by local posttranslational modifications and lipid binding (2016)
  • 著者名/発表者名: Idlir Liko, Matteo Degiacomi, Shabaz Mohammed, Shinya Yoshikawa, Carla Schmidt and Carol V. Robinson,
  • 雑誌名: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 巻: 113 ページ: 8230-8235
  • DOI: 10.1073/pnas.1600354113
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [学会発表] Reaction mechanism of cytohrome c oxidase (2017)
  • 著者名/発表者名: S. Yoshikawa
  • 学会等名: IGER International Symposium on Physics of Life
  • 発表場所: ES hall, Nagoya Yuniversity (愛知県名古屋市）
  • 年月日: 2017-03-25 – 2017-03-26
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Processing of XFELstill images with a reference oscillation data set for crystal structural analyses of cytochrome c oxidase (2016)
  • 著者名/発表者名: L. Fangjia, A. Shimada, K. Yamashita, K. Hirata, M. Yamamoto, K. Shinzawa-Itoh, S.Yoshikawa, T. Tsukihara
  • 学会等名: 第５４回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: つくば国際会議場（茨城県・つくば市）
  • 年月日: 2016-11-25 – 2016-11-27
• [学会発表] Elucidating the nmehanism of proton pumping in cytochrome c oxidase by time resolved IR spectroscopy (2016)
  • 著者名/発表者名: C. Li, T. Nishiguchi, S. Yamauchi, K. Shinzawa-Itoh, S. Yoshikawa, S. Nakashima, T. Ogura
  • 学会等名: 第５４回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: つくば国際会議場（茨城県・つくば市）
  • 年月日: 2016-11-25 – 2016-11-27
• [学会発表] Detailed crystal structural studies of bovine cytochrome oxidase to elucidate the coupling of dioxygen reduction and proton pumping (2016)
  • 著者名/発表者名: T. Tsukihara, A. Shimada, N. Yano, K. Muramoto, K. Shinzawa-Itoh, E. Yamshita, S. Yoshikawa
  • 学会等名: 第５４回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: つくば国際会議場（茨城県・つくば市）
  • 年月日: 2016-11-25 – 2016-11-27
• [学会発表] Complex structure of cytochrome c and cytochrome c oxidase shows a novel inter-protein interaction mode. (2016)
  • 著者名/発表者名: Shimada S, Shinzawa-Itoh K, Baba J, Aoe S, Shimada A, Yamashita E, Kang J, Tateno M, Yoshikawa S, Tsukihara T
  • 学会等名: 第５４回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: つくば国際会議場（茨城県・つくば市）
  • 年月日: 2016-11-25 – 2016-11-27
• [学会発表] Interaction analysis of electron transfer complex formation between cytochrome c-cytochrome c oxidaseusing fluorescence anisotropy (2016)
  • 著者名/発表者名: H. Kagaya, W. Sato, T. Uchida, K. Shinzawa Itoh, S. Yoshikawa, K. Ishimori
  • 学会等名: 第５４回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: つくば国際会議場（茨城県・つくば市）
  • 年月日: 2016-11-25 – 2016-11-27
• [学会発表] The effect of the hydrogen bond network on the oxygen reduction of cytochrome c oxidase (2016)
  • 著者名/発表者名: Y. Aoyagi, T. Nishiguchi, K. Shinzawa-Itoh, S. Yoshikawa, S. Nakashima, T. Ogura
  • 学会等名: 第５４回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: つくば国際会議場（茨城県・つくば市）
  • 年月日: 2016-11-25 – 2016-11-27
• [学会発表] Coupling mechanism of cytochrome c oxidase studied by timeresolved resonance Raman spectroscopy (2016)
  • 著者名/発表者名: S. Nakashima, Y. Nakagawa, K. Shinzawa-Itoh, S. Yoshikawa, T. Ogura
  • 学会等名: 第５４回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: つくば国際会議場（茨城県・つくば市）
  • 年月日: 2016-11-25 – 2016-11-27
• [学会発表] Functional significance of dehydration for formaton of electron transfer complex between cytochrome c and cytochrome c oxidase (2016)
  • 著者名/発表者名: W. Sato, K. shinzawa-Itoh, T. Uchida, P. Brezezinski, S. Yoshikawa, K. Ishimori
  • 学会等名: 第５４回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: つくば国際会議場（茨城県・つくば市）
  • 年月日: 2016-11-25 – 2016-11-27
• [学会発表] High-resolution crystal structure of cytochrome c oxidase reveals the mechanism of highly efficient protonpumping (2016)
  • 著者名/発表者名: A. Shimada, N. Yano, K. Muramoto, E. Yamashita, K. shinzawa-Itoh, T. Tsukihara, S. Yoshikawa,
  • 学会等名: 第５４回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: つくば国際会議場（茨城県・つくば市）
  • 年月日: 2016-11-25 – 2016-11-27
• [学会発表] The Mg2+-containing water cluster of mammalian cytochrome c oxidase collects four pumping proton equivalents in each catalytic cycle (2016)
  • 著者名/発表者名: S. Yoshikawa
  • 学会等名: EBEC 2016, 19th European Bioenergetics Conference
  • 発表場所: Riva del Garda (Italy)
  • 年月日: 2016-07-02 – 2016-07-07
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Processing of XFEL still images with a refference oscillation data set for crystal structural analyses of cytochrome coxidase (2016)
  • 著者名/発表者名: L. Fangja, A. Shimada, K. Yamashita, K. Hirata, K. Shinzwa-Itoh, T. Tsukihara, S. Yoshikawa
  • 学会等名: 日本蛋白質科学会第１６回年会
  • 発表場所: 福岡国際会議場（福岡県・福岡市）
  • 年月日: 2016-06-07 – 2016-06-09
• [学会発表] Structure of complex of cytochrome c and cytochrome c oxidase shows the novel protein-protein interaction style (2016)
  • 著者名/発表者名: Shimada S, Shinzawa-Itoh K, Baba J, Aoe S, Shimada A, Yamashita E, Kang J, Tateno M, Yoshikawa S, Tsukihara T
  • 学会等名: 日本蛋白質科学会第１６回年会
  • 発表場所: 福岡国際会議場（福岡県・福岡市）
  • 年月日: 2016-06-07 – 2016-06-09
• [学会発表] Time resolved crystallographic analysis of cytochrome c oxidase using X-ray free electron laser (2016)
  • 著者名/発表者名: Keita Hatano, Atsuhiro Shimada, Akari Miyamoto, Seiki Baba, Keitaro Yamashita, Minoru Kubo, Hideo Ago, Kunio Hirata, Go Ueno, Hironori Murakami, Masaki Yamamoto, Takashi Kumasaka, Eiki Yamashita, Takashi Ogura, Kyoko Shinzawa-Itoh, Shinya Yoshikawa, Tomitake Tsukihara
  • 学会等名: 日本蛋白質科学会第１６回年会
  • 発表場所: 福岡国際会議場（福岡県・福岡市）
  • 年月日: 2016-06-07 – 2016-06-09
• [学会発表] Development of thawing method of frozen protein crystal for ｈigh resolution crystal structure analysis at room temperature (2016)
  • 著者名/発表者名: Akari Miyamoto, Atsuhiro Shimada, Keita Hatano, Seiki Baba, Takashi Kumasaka, Kyoko Shinzawa-Itoh, Tomitake Tsukihara, Shinya Yoshikawa
  • 学会等名: 日本蛋白質科学会第１６回年会
  • 発表場所: 福岡国際会議場（福岡県・福岡市）
  • 年月日: 2016-06-07 – 2016-06-09
• [学会発表] X-ray crystal structure of F-intermediate of cytochrome c oxidase at 1.6 angstrom resolution (2016)
  • 著者名/発表者名: Yuki Eto, Atsuhiri Shimada, Eiki Yamashita Kyoko Shinzawa-Itoh, Tomitake Tsukihara, Shinya Yoshikawa
  • 学会等名: 日本蛋白質科学会第１６回年会
  • 発表場所: 福岡国際会議場（福岡県・福岡市）
  • 年月日: 2016-06-07 – 2016-06-09
• [学会発表] Dynamics at the reaction site of cytochrome c oxidase studied by time-resolved resonance Raman spectroscopy (2016)
  • 著者名/発表者名: S. Nakashima, Y. Nakagawa, K. Shinzwa-Itoh, S. Yoshikawa, T. Ogura
  • 学会等名: 日本蛋白質科学会第１６回年会
  • 発表場所: 福岡国際会議場（福岡県・福岡市）
  • 年月日: 2016-06-07 – 2016-06-09
• [学会発表] The proton pump mechanism suggested from the crystal structures of cytochrome c oxidase intermediates and their derivatives. (2016)
  • 著者名/発表者名: A. Shimada, J. Baba, E. Yamashita, K. muramoto, K. Shinzawa-Itoh, T.Tsukihara, S. Yoshikawa
  • 学会等名: 日本蛋白質科学会第１６回年会
  • 発表場所: 福岡国際会議場（福岡県・福岡市）
  • 年月日: 2016-06-07 – 2016-06-09