| 研究課題/領域番号 |
26291043
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| 研究機関 | 生理学研究所 |
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研究代表者 |
古瀬 幹夫 生理学研究所, 大脳皮質機能研究系, 教授 (90281089)
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| 研究分担者 |
泉 裕士 生理学研究所, 大脳皮質機能研究系, 准教授 (10373268)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | タイトジャンクション / 上皮細胞 / 細胞接着 / アンギュリン / トリセルリン |
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| 研究実績の概要 |
１）年度当初は、クローディン２欠失MDCK細胞を出発材料として、トリセルラータイトジャンクション（tTJ)の構成分子であるアンギュリン１(LSR)の遺伝子をゲノム編集法の一つであるTALENにより欠失させる予定であった。しかし、並行して行ってきた実験から、TALENより簡便で汎用性も高いCRISPR/Cas9によるゲノム編集法が、マウス乳腺由来上皮細胞株EpH4にも適用できることが確認された。EpH4細胞はこれまで当グループでtTJ構成分子の機能解析に用いてきた細胞株である。そこで、本研究で得られる解析結果を従来の研究結果と比較できる利点を重視して、年度当初の方針を変更し、MDCK細胞の代わりにEpH4細胞をベースにしてCRISPR/Cas9によりアンギュリン１欠失細胞を取得した。この細胞では、本来アンギュリンファミリーによってtTJにリクルートされるトリセルリンがtTJに濃縮しないことが確認された。
２）年度当初の計画に従い、自作の抗トリセルリンウサギ血清をアフィニティー精製した抗体を用いて、MDCK細胞をベースにトリセルリン欠失細胞の取得に成功した。ところが、先述のように、EpH4細胞においてCRISPR/Cas9システムによる遺伝子編集が可能となったため、用いる細胞をEpH4細胞に変更し、トリセルリン欠失細胞の樹立を試み、取得に成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
年度当初は、MDCK細胞を用いてTALEN法によりゲノム編集を行う予定で実験を進めていたが、並行して進めていた、より簡便なゲノム編集法であるCRISPR/Cas9法が年度途中から動き出し、かつ従来のtTJ構成分子の解析で用いてきたEpH4細胞に適用できることがわかった。本研究を従来の研究成果と比較する上では、従来私がtTJ研究に用いてきたEpH4細胞で本研究を進める方が最終的に有利であると判断し、アンギュリン１，トリセルリンをそれぞれ欠失する細胞をEpH4細胞で取得し直したため遅れが生じている。いずれも細胞の取得には成功している。現在、これら細胞に全長のアンギュリン１あるいはトリセルリン、その変異分子を導入した細胞株を作製中であるが、年度予定に含まれていたバリア機能の測定には至っていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究の遂行に必要なアンギュリン欠失上皮細胞、トリセルリン欠失上皮細胞はいずれも取得できており、今後計画通りこれらの細胞を用いて研究を進める。具体的には、アンギュリンファミリー各サブタイプの全長、キメラ分子、変異分子、あるいはトリセルリンの全長、変異分子をこれらの細胞にそれぞれ戻し、上皮バリア機能におけるアンギュリンサブタイプ間の機能差の責任ドメイン、トリセルリンの上皮バリアと細胞形態制御における責任ドメインを決める。研究の遅れを取り戻すため、28年度は研究室の特任助教に参画してもらう。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究代表者が研究費を執行する研究機関を神戸大学から生理学研究所に移し、生理学研究所において新しい研究室を立ち上げたため、研究が一時停滞し、軌道に乗るまでに時間を要した。さらにその影響を受けて、予定していた実験動物の飼育が年度内に開始できなかった。このような理由から研究が全体にやや遅れており、次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
28年度は研究室の特任助教を研究分担者に加え、本研究を中心的に担当してもらうことで、遅れが生じていた研究の遂行を加速させる。また、動物飼育を業者委託により再開し、実験動物を効率よく繁殖させて研究に用いる。そのために増加する物品費と飼育委託費に次年度使用額を充てる予定である。
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