| 研究課題/領域番号 |
26291048
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
甲斐 歳恵 大阪大学, 生命機能研究科, 教授 (40579786)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 生殖細胞 / 非コードRNA |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、モデル生物のショウジョウバエを用いて、雌雄の生殖幹細胞、分化の最終段階である卵細胞、雄性生殖細の分化の重要なステップである第一減数分裂を始めた第一精母細胞、のそれぞれに細胞集団を単利師、得意的に発現している調査非コードRNAを次世代シーケンシングとバイオインフォマティクスにて、それぞれのステージにおいて特異的に発現している新規長鎖非コードRNAを同定し生殖細胞の分化過程における非コードRNAの発現ネットワークを網羅的に解析している。現在、それぞれのサンプルのシーケンシングは終了し、バイオインフォマティックスのパイプラインを構築して解析中である。プレリミナリーに得られた興味深い発現パターンを示す新規非コードRNA候補について、pRT-PCRを用いて生体内での発現レベルとパターンの確認を進めている。また、CRISPR—Cas9のシステムを用いて候補遺伝子のノックアウト株の作成、およびsiRNAの発現による機能ノックダウン株の作成を開始した。それぞれの卵発生・精子発生を観察し、異常が見られる機能欠損株に対して、それぞれの発生以上についての詳細を解析する予定である。また、派生プロジェクトとして、非コードではなくコーディングの転写産物の発現ネットワークおよび選択的スプライシングパターンの卵と精子発生過程における経時変化も解析中であり、非常に興味深い特徴を示すことが明らかになりつつある。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
２６年度から開始した研究室の異動は２７年度の申請者の異動をもって完了したが、ラボの立ち上げに際して予想外の困難に直面した。実験材料のショウジョウバエの飼育条件の安定化に時間がかかった。リナックスのサーバーがレイドでバックアップしていたにも関わらず、故障し、バイオインフォマティックスで解析したbam fileが消失するというトラブルがあった。現在、ファイルの修復をほぼ終了した。このトラブルにも関わらず、本提案のプロジェクトから派生した精巣の分化過程に特異的な非コード小分子RNAに関する論文をRNA誌に投稿し、リバイズの後に受理された（The piRNA pathway is developmentally regulated during spermatogenesis in Drosophila, in press）。また、２７年度中には、生殖巣に特異的に発現する非コードRNAであるpiRNAについての総説論文を執筆し、 Sem Cell Dev Biol に掲載された。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き、パイプラインでの解析を進め、バイオインフォマティックス解析をまとめた論文作成をにとりかかり、年度内での投稿、受理を目指す。機能解析については、CRISPR-Cas9系でのノックダウン株の作成は進行中であるが、インジェクションのシステムを安定的に運用できるように改善に取り組んでいる。また、現時点でのプレリミナリーな解析結果から得られた非コードRNA候補について生体内での発現パターンの検証は定量的RT-PCRによって解析を進めているが、これをさらに拡充する。他の組織幹細胞もしくは腫瘍細胞との比較検討の過程で、必要に応じて次世代塩基対解析を行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初計画では、トランスジェニックバエ作成用のインジェクターのシステム一式を購入する予定であったが、一部のパーツを既存のもので流用できることが判明したため、不足分のパーツのみを購入した。また、次世代塩基配列解析の費用を多く見積もっていたが、今年度はサンプル調整が困難であったため、次年度に解析することとした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
今年度解析できなかった次世代塩基配列解析を次年度（H２８年度）に行う。さらに、その解析結果をに基づいて定量的PCRを行い、変動している遺伝子発現を同定する予定である。これら両方の解析にかかる試薬類の消耗品が多額となる見積もりであるため、設備費の一部を消耗品費とする予定である。
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