| 研究課題/領域番号 |
26291049
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
渡邉 正勝 大阪大学, 生命機能研究科, 准教授 (90323807)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | ギャップジャンクション / ゼブラフィッシュ / 細胞間相互作用 |
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| 研究実績の概要 |
生物の形態形成において、細胞が集団を作り組織を構成していく。我々のこれまでの研究により、この過程にギャップジャンクションが重要な機能を担っていることが明らかとなってきた。これまでに、ゼブラフィッシュの体表模様を指標に、そのパターン形成研究を行ってきたが、ギャップジャンクション構成蛋白の一つ、コネキシン41.8がストタイプ形成に関与していることを示してきた。また、コネキシン41.8の変異体がパターンの人為的な変換に関与していることを示してきた。更に最近、海外のグループからコネキシン39.4もパターン形成に関与していることが発表された。今回、ゼブラフィッシュのパターンを人為的に変化させる変異体、すなわち、ゼブラフィッシュの体表上で黒色素細胞の集団サイズ及び黄色素細胞との細胞間距離を変化させる変異体の機能解析及びコネキシン41.8とコネキシン39.4の機能創刊に関する解析を行った。実験計画段階ではコネキシンタンパク質複合体によるギャップジャンクションの電気生理解析のほかに、発現解析を計画していたが、電気生理解析の条件検討等に時間がかかり、一部H27年度に延長して実験を進めた。その結果、コネキシン41.8のN末ドメインを削った変異体(Cx41.8M7)ではギャップジャンクションのコンダクタンスが失われていること、更には野生型コネキシン41.8との共発現（ヘテロ12量体）でも、機能阻害を行っていることが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ギャップジャンクションの変異体の機能解析はアフリカツメガエル卵母細胞を用いた電気生理解析による行うことを計画していた。これは、ターゲットとするコネキシン41.8が、哺乳類培養細胞での発現が悪く、膜局在が見られず、パッチクランプ法やアップテイクアッセイなどができないためである。このため、本研究に先立ちH25年度にアメリカ・ニューヨーク州立大学を訪ね電気生理解析法を習得してきたが、一方でアフリカツメガエル卵母細胞の質に季節的要因があり、実験の遅延を招いてしまった。この件に関しては、H27年度に計画延長を行い、延長計画通りに実験結果が得られた。この結果はH27度中にJournal of Biological Chemistryに受理されることができた。
上記コネキシン41.8、コネキシン39.4以外のコネキシンがゼブラフィッシュの体表模様形成及び形態形成に関与しているかどうかを明らかにする目的で、NGSを用いたトランスクリプトーム解析とCRISPRを用いたノックアウト個体の作製を行っている。発現量の多い遺伝子から順次遺伝子導入を進めており、次年度にはいくつかの結果が得られるものと期待される。
ギャップジャンクションに関連して、ゼブラフィッシュの脊椎骨に異常が見られる解析の中で、コネキシン４３に変異を見つけることができた。この変異がどのような機能変換を引き起こしているのかについて、解析を進める予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
上記のように、H26年度中に終了する予定であったコネキシン41.8とコネキシン39.4からなるギャップジャンクションの電気生理解析の条件検討に時間がかかり、一部をH27年度に持ち越した。このため、H26年度中行う予定のタンパク質の発現解析を一部行うことができなかった。H27年度には、コネキシンの発現解析、ノックアウトの作製を行い、継体形成、細胞集団形成におけるギャップジャンクションの機能解析を進めていく予定である。
また、H27年度は黒色素細胞と黄色素細胞間に存在する細胞間相互作用の解析を所属の研究室で確立したin vitro細胞培養－タイムラプス記録形を用いて詳細な解析を行う予定である。特に、コネキシン41.8にタグをつけたタンパク質を発現させた遺伝子組換え体が複数ライン（His Hag, Myc Tagなど）得られてきた。コネキシン41.8においてはN末、C末ドメインでは機能しなかったため、細胞内ループドメインにタグを挿入した組換え体であり、コネキシン41.8の欠損個体に導入して機能していることを確認してある。次年度はこれらを用いたin vitroでの発現解析を行い、細胞間相互作用時における機能解明を目指していく。
更に、体表模様研究とは独立して行ってきた研究の過程で脊椎骨の形態形成（パターン形成）にコネキシン４３が関与していることが明らかになってきた。この問題は、ギャップジャンクションによる形態形成を考える上で非常に重要な課題であるので、H27年度にその詳細な解析を行う計画である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成26年8月、電気生理解析の過程で、アフリカツメガエル未受精卵の質にばらつきが生じ、電気生理実験によるギャップ結合の機能解析で安定したデータが取れない事態となった。そのため、ギャップ結合実験の条件再検討を行い、良い測定条件を定めてからギャップ結合の機能解析を再開する必要が生じた。
平成２６年８月までに、電気生理実験によるギャップ結合の機能解析とその評価を終え、平成27年3月までに、遺伝子組み換えゼブラフィッシュの作製とその評価、およびギャップ結合変異体の機能解析とその評価を行い、研究成果を取りまとめる予定であったが、実験計画の遅延が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
色素細胞のin vitro、in vivoイメージングを行うため、顕微鏡を購入する。購入した顕微鏡を用いて、黒色素細胞と黄色素細胞の間で起きる相互作用の解析を、野生型、コネキシン変異体それぞれで行い、コネキシンの機能解明を目指す。
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