| 研究課題/領域番号 |
26291054
|
|---|
| 研究機関 | 埼玉大学 |
|---|
研究代表者 |
竹澤 大輔 埼玉大学, 理工学研究科, 准教授 (20281834)
|
|---|
| 研究分担者 |
坂田 洋一 東京農業大学, 応用生物科学部, 教授 (50277240)
梅澤 泰史 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (70342756)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
| キーワード | SnRK2 / キナーゼ / 環境ストレス |
|---|
| 研究実績の概要 |
植物は気温の低下や土壌および組織内部の水ポテンシャル低下に反応してアブシジン酸（ABA）を合成し、気孔の閉鎖を引き起こす一方、乾燥や凍結への耐性を獲得する。この過程ではABAにより誘導される凍結や乾燥に対し保護的に働くタンパク質が蓄積して、細胞傷害が回避されている。SNF1-related protein kinase2 (SnRK2)は、ABAや乾燥の情報伝達プロセスにおいてイオンチャネルや転写因子の活性化に関わるプロテインキナーゼであるが、SnRK2自身の活性化の仕組みについては不明な点が多い。SnRK2を介した環境応答の仕組みは、陸上植物の起源に近いとされるコケ植物にも保存され、植物に普遍的な仕組みであると考えられる。我々は、ABA非感受性のヒメツリガネゴケAR変異株の解析から、環境応答の制御に関わる遺伝子ARKを同定した。ARKはRaf様MAPキナーゼ・キナーゼ・キナーゼをコードし、ark変異株はABAだけでなく、乾燥や高浸透圧、低温応答にも欠損がある。生化学的解析から、ARKはSnRK2アイソフォームの一つ、PpSnRK2Bのセリン165・169をリン酸化し活性化することが示唆された。これらセリンをアラニンに置換したPpSnRK2B_AAは活性を失うことが示された。ARK自身も特定のセリン1029がリン酸化されることがリン酸化ペプチドマッピングにより明らかとなった。部位特異的変異実験によりセリン1029をアラニンに置換すると、ARKはABA応答を活性化しないことが、遺伝子の一過的発現実験および形質転換体の解析から明らかとなった。ARKのセリン532に変異を持つAR7変異株ではABAによるセリン1029のリン酸化がおこらないことが示唆された。これらの結果から、ARKとSnRK2によるリン酸化を介したABA情報伝達の仕組みが明らかとなった。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度までにARKの特徴づけに関する論文を発表することができた。論文では、ARKの同定に至る変異株の特徴、すなわちマイクロアレイ解析の結果、ノーザン解析によるRNA発現、ゲル内キナーゼアッセイによるSnRK2の活性化と、同定した遺伝子産物の解析結果について述べた。特に、リコンビナントタンパク質を用いたキナーゼアッセイでは、GST-ARKがMBP-PpSnRK2Bをリン酸化し、活性化する仕組みが明らかとなった。さらに、リン酸化ペプチドマッピングから、PpSnRK2Bのアクチベーションループ内に存在する２つのセリン残基のリン酸化が検出された。このうちセリン169はイネやシロイヌナズナにおいて同定されている、活性化に必要なリン酸化部位に相当する残基であることが明らかとなり、コケ植物において同様の活性化機構でSnRK2が調節を受けていること、さらに、ARKというMAPキナーゼキナーゼキナーゼがその活性化に重要な働きをしていることが示唆された。ARKは、MAPKKKではB3グループに属するキナーゼである。このグループに属するMAPKKKはシロイヌナズナでは６遺伝子存在しており、エチレンシグナルに関わるCTR、病原菌応答に関わるEDR1などが知られている。コケのARK欠損株への遺伝子の一過的発現実験により、シロイヌナズナB3-MAPKKKのうち、３つのアイソフォームのみがARKの変異を相補することが明らかとなった。一方、CTR1やEDR1はARKの欠損を相補しなかった。このことは、グループB3MAPKKKが、ABAや浸透圧応答という原型的な機能から、植物進化の過程で多様化してきたことを示唆している。さらに最近ではB2グループのMAPKKKについても機能解析を進めている。
|
| 今後の研究の推進方策 |
最終年度である本年度は、コケのSnRK2のアイソフォームの機能について解析を進めていきたいと考えている。昨年度までにARKがPpSnRK2Bをリン酸化により活性かすることがあきらかとなったが、最近の酵母ツーハイブリッド系の実験からは、別のアイソフォームであるPpSnRK2DがARKとより強く相互作用することが明らかとなっている。PpSnRK2Dのアクチベーションループ内のリン酸化はPpSnRK2Bのそれと異なるという予備的な証拠もえている。リコンビナントタンパク質を用いたキナーゼアッセイ、部位特異的変異の導入、リン酸化ペプチドマッピングなどにより、その活性化の仕組みを明らかにしたいと考えている。また、ARKについては欠失解析と酵母ツーハイブリッド系による相互作用実験から、活性化に関わるドメインの特定を行いたい。これまでの欠失解析ではN末端から470アミノ酸付近のところに負の制御ドメイン、500以降のところに正の制御領域があることが示唆されている。この領域のさらなる欠失、部位特異的変異の導入と遺伝子の一過的発現実験により、キナーゼの正と負の両方の制御機構を明らかにしたい。特定したドメインがキナーゼ活性を制御する仕組みについては、酵母ツーハイブリッド系により制御ドメインとキナーゼの活性化部位との相互作用を調べたいと考えている。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
２７年度中にリン酸化解析用に残しておいた予算が、分析機器の故障のため、解析を次年度（２８年度）に行うことになった。実験に必要な試薬・アイソトープ等は使用期限・半減期などの関係から前年度中に購入しておくことが難しいため、やむを得ず２８年度に購入することになった。
|
| 次年度使用額の使用計画 |
リン酸化解析の実験のために本年度前期中に使用を計画している。主にアイソトープを含む試薬類の購入に充てる予定である。
|
