| 研究課題/領域番号 |
26291068
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
久保 健雄 東京大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (10201469)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | ミツバチ / 社会性行動 / 尻振りダンス / キノコ体 / ケニヨン細胞 / ゲノム編集 / mKast / PLCe |
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| 研究実績の概要 |
ミツバチは社会性昆虫であり、尻振りダンスで餌場の情報を仲間に伝える等、高度な社会性行動を示す。従来、ミツバチ脳の高次中枢であるキノコ体は異なる遺伝子発現プロフィルをもつ3種類（クラスI大型と小型、クラスII）のケニヨン細胞から構成されると考えられてきた。しかし、申請者らは、mKastと命名した遺伝子が選択的に発現するクラスI中間型ケニヨン細胞を同定し、ミツバチのキノコ体が4種類のケニヨン細胞から構成されることを示した [Kaneko et al. PLoS ONE (2013)]。採餌蜂では小型ケニヨン細胞と一部の中間型ケニヨン細胞が活動する。そこで本研究では、mKastを中心に、ケニヨン細胞の各サブタイプ選択的に発現する遺伝子を用いて、これら遺伝子の機能解析を進めると共に、各サブタイプが変態のどの段階で誕生し、ハチ目昆虫の進化のどの段階で獲得されたか検討することを目的とした。
今年度は、大型ケニヨン細胞選択的に発現する遺伝子3種類の遺伝子（PLCe, Syt14, dlg5）について幼虫、蛹、成虫脳での発現を調べたところ、PLCeが全ての段階で発現したのに対し、Syt14とdlg5は成虫でのみ発現することが判明し、幼虫と成虫のキノコ体が異なる機能をもつことを示唆した[論文投稿中]。社会性進化の段階が異なるツチバチ（単独性、縄張りをもつ）とスズメバチの脳での発現解析は現在進行中である。さらにmKastも成虫脳でのみ発現することを示すと伴に、蛍光抗体法により、mKastがキノコ体の他、視葉や触角葉、食道下神経節の一部のニューロンに局在することを示し、mKastの脳内での多機能性を示唆した[論文投稿中]。またローヤルゼリータンパク質遺伝子（mrjp1）を標的としたゲノム編集法により、mrjp1をノックアウトしたミツバチ（雄蜂）の作出に世界で初めて成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
平成27年度の最大の研究成果は、ミツバチで初めてゲノム編集法による遺伝子ノックアウト技術を確立したことである [Zool. Sci. in press (2016)]。これまで我々のグループを含め、世界の幾つかのグループが、ミツバチの社会性行動や高次脳機能に働く候補遺伝子を同定してきたが、簡便で有効な逆遺伝学的手法がなかったため、その生体機能は不明であった。本法の確立により、ミツバチ遺伝子の生体機能解析が初めて可能になった。国際的にもミツバチ生物学のレベルを一段向上させる成果と言える。
またミツバチ成虫のキノコ体が幼虫と一部、共通な分子的性質（PLCeの選択的発現）をもつものの、成虫固有な性質（Syt14とdlg5, mKastの選択的発現）をもつことが示された。Syt14とdlg5の発現は大型ケニヨン細胞、mKastの発現は中間型ケニヨン細胞固有な性質であることが判明した。さらに、mKastが成虫脳のキノコ体の他にも、視葉、触角葉、食道下神経節の一部の神経回路に局在することを見いだし、これら神経回路が社会性行動に関わる可能性を指摘した（2報の論文として伴にPLoS ONE誌に投稿中）。ミツバチの社会性行動は成虫に見られるため、ゲノム編集法を用いた研究の対象とする遺伝子は、発生段階で機能しないことが望まれる。この点でも、Syt14とdlg5、mKastはゲノム編集法の標的遺伝子として適している。
今年度はこの他に、ミツバチ働き蜂の分業に伴う生理状態変化をエクダイソンと幼若ホルモンが協調的に制御することを見いだし、論文発表した [Ueno et al., PLoS ONE (2015)]。また北海道大学の渡邊崇之博士が独自にクラスIIケニヨン細胞選択的に検出される抗原を同定され、共著論文として発表した [Watanabe & Kubo, Biophysics (2015)]。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成28年度は、平成27年度の成果に基づき、以下の3つの研究課題を遂行する。(1) PLCeの働き蜂の社会性行動における機能解析。PLCeはカルシウム情報伝達系で働く酵素なので、記憶・学習に関わる可能性がある。PLCeは幼虫キノコ体でも発現するため、ゲノム編集法の標的遺伝子としては適切でないかも知れないが、特異性の高い阻害剤があるため、これを用いて嗅覚―口吻伸展反射連合学習や、尻振りダンスを含めた採餌行動における機能解析を行う。(2) mKastのゲノム編集によるノックアウト個体の作出。sgRNAとCas9 mRNAを初期胚に注入し、人工王台に移すことにより、女王蜂を育成する。その子孫（雄蜂）のゲノタイピングにより、変異体雄蜂を得て、その精子を得る。この精子を用いて野生型女王蜂を人工授精させて、その子孫の女王蜂（ヘテロ変異体）を得る。この女王蜂を再度、変異体雄蜂の精子で人工授精させることで、その子孫として働き蜂（ヘテロとホモ変異体）を得る。世代時間を考えると平成28年度に実施できるのは変異体働き蜂を得るところまでであり、この系統を維持する技術を開発する。(3) 様々な社会性段階にあるハチ目昆虫（スズメバチ手・マルハナバチ＝真社会性、クマバチ＝亜社会性、ツチバチ＝単独性で縄張りをもつ、ハバチ＝単独性）から、それぞれ大型、中間型、小型ケニヨン細胞のマーカーとしてSyt14、mKast、EcRを同定し、これらのハチの脳切片を用いたin situハイブリダイゼーション法を行うことで、大型と中間型、小型ケニヨン細胞がどの社会性段階にあるハチ目昆虫で獲得されたか検討する。
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