| 研究実績の概要 |
分裂酵母のヒストンメチル化酵素であるClr4は、Rik1、Cul4、Raf1、Raf2とともにCLRC複合体を形成しており、ユビキチン化との関連が示唆されているがその詳細は不明であった。昨年度までの研究によって、ヒストンH3の14番目のリジンがCLRCによって優先的にユビキチン化されること、ユビキチン化の存在によってClr4のメチル化活性が促進されることを見いだした。本年度はこれらの成果に基づき、H3のユビキチン化の動態を検討した。
分裂酵母はヒストンH3をコードする遺伝子としてhht1+, hht2+, hht3+を持っている。このうちhht1+に3xFLAGタグを付加するための配列を導入し、FLAGタグを付加したH3を発現する分裂酵母株を構築した。この株を用いて、まず抗FLAG抗体を用いてウェスタンブロットを行ったところ、H3自身のシグナルに加えて泳動度の遅い2本のバンドが検出され、これらの泳動度はモノユビキチン化、ジユビキチン化されたH3の泳動度に相当することが分かった。さらにプラスミドを導入してGSTユビキチンを過剰発現させると、これらのバンドの移動度が変化することから、これらのバンドがユビキチン化されたH3であると結論づけた。
この株を用いてCLRCの構成要素をコードする遺伝子の破壊株を組み合わせ、ユビキチン化H3に相当するバンドの変化を確認した。その結果、CLRCの構成要素の欠損によって、ユビキチン化H3に相当するバンドのシグナルが減少していることが明らかになった。以上の結果より、CLRCが分裂酵母の細胞内でH3のユビキチン化を制御していることが強く示唆された。
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