| 研究課題/領域番号 |
26291073
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
藤島 政博 山口大学, 創成科学研究科, 教授(特命) (40127783)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 細胞内共生 / 二次共生 / ミドリゾウリムシ / 共生クロレラ / 細胞進化 / モノクローナル抗体 / 感染 |
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| 研究実績の概要 |
ミドリゾウリムシの共生クロレラを包んでいる宿主食砲膜由来の単位膜のPerialgal vacuole membrane (PV膜）に対するモノクローナル抗体を作成できたので、その抗体を使用して再共生過程での抗原の出現時期について調べ直した。予め共生クロレラを除去した白色のミドリゾウリムシ（Yad1w株）に、クロレラ (Chlorella variabilis, 1N株）を共生させた緑色の宿主（Yad1g1N株）から単離したクロレラ1N株を90秒混合し、混合液を15μm穴のナイロンメッシュでろ過して外液のクロレラを除去し、継時的にミドリゾウリムシを固定して、間接蛍光抗体法で抗原がPV膜に出現するタイミングを調べた。抗原は、混合後12時間以上経過してPV膜に出現した。このことは、チェックポイント4以降にこの抗体の抗原が出現することを示している。宿主の株特異性を間接蛍光抗体法で調べたところ、PV膜がこのモノクローナル抗体で標識される株と標識されない株があることが分かった。さらに、この抗体ではPV膜が標識されないミドリゾウリムシの白色株を作成して、それに1N株を共生させても抗体の交差反応性が見られなかったことから、この抗原は宿主由来で、抗原決定基には宿主株特異性があることが示唆された。抗原はイムノブロットでは検出できず、精製はまだ成功していない。
ゲノム解読済みの共生クロレラ (C. variabilis, NC64A株）が宿主細胞質内に共生しているときと、宿主外培養している時の遺伝子発現の変化を比較するために、トランスクリプトーム解析を実施中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
再共生に必要な４つのチェックポイントの調節機構のうち、２つ目（食砲膜の出芽）に関与すると予測されたダイナミンの検出が市販の抗体ではできていない。３つ目（PV膜の分化）に関与するPV膜特異的モノクローナル抗体が１種しかできていない。４つ目（PV膜とミトコンドリア外膜との接着）を調節する接着物質の抗体が作成できていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．市販のダイナミン抗体をもっと購入して、食胞膜が出芽する際にリング状に膜を標識する抗体を探す。
２．PV膜を弱く染めるモノクローナル抗体が複数取れているので、その特異性を確認し、使用できる抗体を検出し、抗原を精製する。
３．ミトコンドリア膜特異的モノクローナル抗体も複数取れたので、PV膜との接着に関与する抗原を標識する抗体を探す。
４．実験計画に沿って、人為的二次共生の誘導を実施する。
５．共生クロレラのRNAseqのデーターをまとめる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度使用額が生じた主な要因は、平成２８年度に実施予定の学会発表等の出張の一部を取りやめたことによる。予定の実験計画の遂行のために、出張を削減せざるを得なかった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
市販のダイナミン抗体の購入費用が予定より多く必要になったので、平成２９年度の研究費と合わせて抗体の購入費用として使用する。
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