| 研究課題/領域番号 |
26292037
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
阿部 敬悦 東北大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (50312624)
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| 研究分担者 |
矢野 成和 山形大学, 理工学研究科, 助教 (50411228)
佐野 元昭 金沢工業大学, 公私立大学の部局等, 教授 (80410299)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 糸状菌 / シグナル伝達 / 細胞壁 / 多糖 / 分化 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、糸状菌のα-1,3-グルカン(AG)が細胞接着を介して菌糸塊形成と有性生殖に関与することを明らかにする。
1.Cell Wall Integrity(CWI)経路-AG生合成系による有性生殖生殖制御機構の解析～Aspergillus nidulans agsAΔ株, agsBΔ株, agsAΔagsBΔ株を作出し、有性生殖試験を実施した結果、各株で頻度は異なるものの有性世代が回り有性生殖器官を形成した。さらにagsA及びagsB遺伝子プロモーター下流にGFPを融合したpagsA-GFP, pagsB-GFPを野生株に導入して有性生殖を行った結果、両遺伝子共にHulle cellで発現した。
2.AgtAの精製と糖転移産物の解析～GPIアンカーを除去したAspergillus oryzae(麹菌) AgtAのPichiaでの発現・精製に成功した。糖転移反応を解析した結果、α-1,3の転移活性は低く、maltoseを受容体にした1,4転移活性が強かった。
3.麹菌の細胞内AG primer合成酵素遺伝子amyGの解析～前年度にprimer合成酵素遺伝子がamyG, amyHの2種類あることを見出した。単独破壊株amyGΔ, amyHΔ,と二重破壊株 amyGΔ,amyHΔを造成した結果、二重破壊株でのみ細胞壁AGの70%が減少し、麹菌では両酵素が機能することを明らかにした。
4.AGの化学構造と凝集性の解析～A. nidulans agsAΔagsBΔ二重破壊株に、agsAまたはagsBを単独発現させて、AGを精製してその化学構造を解析した。両酵素で合成されるAGは、90%以上1,3-結合であり結合様式には差が無く、AgsBの合成する重合度は、AgsAの合成する重合度の約2倍であった。AgsA単独発現株は、AgsB単独発現株よりも菌糸凝集が緩い表現型を示した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度は、以下の大項目4つを実施した。
1. Cell Wall Integrity(CWI)経路-AG生合成系による有性生殖生殖制御機構の解析~達成度は100%である。2. AgtAの精製と糖転移産物の解析～達成度は80%である。3. 麹菌の細胞内AG primer合成酵素遺伝子amyGの解析～達成度は80%である。4. AGの化学構造と凝集性の解析～達成度は100%である。平成28年度はキャンパス移転に4カ月を要して実験の中断があったために、2、3の項目で遅れが出た。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成28年度のキャンパス移転の遅れを取り戻すべく、以下の1. 2. を実施する。さらに28年度に新たに発見した麹菌の菌糸接着因子に着想を得て、麹菌菌糸の完全分散に成功したので、3. の研究を行って特許出願を行う。
1.フェロモン経路変異株の有性生殖能の解析～共同研究先より入手したA. nidulansフェロモン経路のMAPKK構成的活性化株におけるAG合成関連遺伝子の転写解析を行う。
2.麹菌AmyG, AmyH, AgtAの糖転移反応の解析～AgtAに関しては糖転移反応の解析を実施したが、さらに異なる糖の供与体・受容体を用いて転移反応を解析する。新たにAmyG, H両酵素がプライマー合成能を有することが示唆されたので、大腸菌発現・精製酵素を用いて転移反応を解析する。
3.麹菌での新たな菌糸凝集因子の解析と高密度培養法の特許化～麹菌はagsA, agsB, agsCの3種のAG合成酵素を有しているが、それら3種の遺伝子全てを破壊しても、A. nidulans agsAΔagsBΔ二重破壊株が完全分散したのとは異なり、小さな菌糸塊を形成して完全分散はしなかった。さらに解析を進めた結果、AGに加えて新たな菌糸接着因子としてGalactosamino-galactan (GAG)を同定した。麹菌のagsAΔagsBΔagsCΔ-gagΔ株を造成したところ完全分散に成功した。agsAΔagsBΔagsCΔ-gagΔ株の高密度培養―酵素高生産性を確認し、特許出願明細書作成中である。近日中に特許出願を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成28年度後期にキャンパス移転があったために、実験が停止し遅れが生じた。特に多糖の構造解析に使用するGC-MSやLC装置の移設後の組上げ・調整に想定外に手間取り、多くの細胞壁変異株の多糖構造解析が予定通りに進まず、研究計画遅延の大きな要因となった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
遅延した細胞壁変異株の多糖構造解析の実験のために、LC用カラムや試薬の購入に使用する。
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| 備考 |
研究内容および業績を紹介している。
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