| 研究課題/領域番号 |
26292051
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
山篠 貴史 名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (00314005)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 概日リズム / 概日時計 / 温度 / 光 |
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| 研究実績の概要 |
あらゆる生物において、暗期前半と暗期後半の温度入力は、それぞれ、概日リズムを前進、後退させるリセットシグナルであることが知られている。遺伝学的解析から、概日リズムのリセットを司る遺伝子(PRR9,PRR7,TOC1)の制御に関与する遺伝子として、elf3変異を同定した。ELF3を含むLUX/PCL1-ELF3-ELF4転写制御因子複合体をコードする遺伝子の変異体（elf4,elf3,lux）を用いて、概日リズムの温度リセットに関する表現型を解析したところ、いずれの変異体においても PRR9, PRR7, LNK1 の発現が暗期後半に脱抑制されており、この時間の温度入力に対する応答が消失していることがわかった。そこで、ELF3promoter:ELF3-YFP,LUXpromoter:LUX-GFP 形質転換植物体を用いたクロマチン免疫沈降(ChIP)実験で核内の動態を解析したところ、ターゲットプロモーターの特定の cis 配列に結合していることが明らかになった。さらに、ターゲットへの結合は 温度に依存的で、高温入力により感受性を示すことを示した。この原因を明らかにするために、核内のELF3タンパク質の含量を検出したところ高温で減少することを見いだした。このことは、ELF3の温度安定性が位相応答の本質的要因であることを示唆している。以上より、リセット因子の制御に関与するtrans因子の性質を明らかにすることができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
本年度は暗期後半の入力に応答してその直後に発現開始位相を前進させるPRR9, PRR7遺伝子の調節にあずかるtrans制御因子としてELF3を同定することができ、所期の目標を達成することができた。さらに、来年度計画していたLUX-ELF3-ELF4複合体の生化学的性質として温度変化に応答してプロモーター結合活性が低下していること、その要因はELF3タンパク質の核移行と安定性にあることを明らかにすることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
温度入力によるELF4-ELF3-LUX複合体のターゲット時計遺伝子への結合能の感受性変化を説明しうる分子機構が、温度受容機構の本質的理解に結びつくと考えられる。 (1)サブユニットタンパク質の安定性、(2)サブユニット間の相互作用の変化に伴う核移行制御が温度感受性である可能性が考えられる。(1)に対応し、epitopeタグ付きタンパク質を発現する形質転換体(ELF4or35S:ELF4-HA,ELF3or35S:ELF3-HA,LUXor35S:LUX-GFP)を利用して、温度入力後のタンパク質の安定性を westernblotting 法で解析する。(2)に対応し、蛍光タンパク質 YFP の N 末(nYFP)または C 末(cYFP)との融合体を発現するプラスミド(pELF4-cYFP,pELF3-nYFP,pLUX-cYFP)を作製し、各プラスミドを導入した agrobacterium を植物体(N.benthamiana) に coinfiltration する。形質転換された表皮細胞を用いて BiFC 法により 温度入力に依存した ELF3-ELF4,ELF3-LUX 間の相互作用を解析する。また、蛍光タンパク質との融合体を発現する形質転換体(ELF4:ELF4-GFP,ELF3:ELF3-YFP,LUX:LUX-GFP)を利用して、温度入力後のタンパク質の細胞内局在を共焦点レーザー顕微鏡で解析する。以上より、温度入力による ELF4-ELF3-LUX 複合体の動態変化を総合的に解明し、 温度受容機構に関する知見を得たいと考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成26年9月に暗期における温度と光のシグナルは相乗的に概日時計への入力シグナルとして機能するという新しい知見を得た。本研究課題の遂行上、この作用機構を理解することが重要であると考え、研究計画をみなおすこととした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
光入力パルスによる概日時計遺伝子の発現リズムの位相応を明らかにした後に、概日時計への入力シグナルとして温度と光をともに視野に入れて概日時計のリセット機構を解明することとした。
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