| 研究実績の概要 |
本研究の目的は基質特異性を改変した分裂酵母のピルビン酸転移酵素Pvg1を用いて新奇なピルビン酸含有N-結合型糖鎖および糖タンパク質を合成する手法を確立する。さらにピルビン酸含有糖タンパク質が高等動物生体内でどのような動態を示すのか明らかにすることである。今年度までの研究で以下のことについて明らかにすることができた。
(1)分裂酵母の糖鎖へのピルビン酸付加に重要なPvg1/ピルビン酸転移酵素の立体構造を明らかにできた。これは糖鎖へピルビン酸を転移する酵素としては初めての報告である。本酵素の活性中心付近の構造解析から、活性に重要なアミノ酸も特定され、実際にこれらのアミノ酸をアラニンに置換すると酵素活性が著しく低下することもわかった。基質となりうる二糖としてラクトースを配置した所、還元末端のグルコースの2位の位置に168番目のヒスチジンが極めて隣接していることが予想され、ヒスチジン残基がGalβ1,4GlcNAcへのピルビン酸の転移を阻害していることが示唆された。(2)立体構造結果をもとにPvg1変異体を作成してN-結合型糖鎖にピルビン酸を転移できる変異体を作ることができた。Pvg1タンパク質の立体構造解析結果から、168番目のヒスチジン残基をアラニンに点変異させたPvg1H168A変異体を作製した。解析の結果、Pvg1H168A変異体はPvg1野生型が転移できなかったGalβ1,4GlcNAcへピルビン酸を転移できることが明らかになった。さらにGalβ1,4GlcNAcを基本骨格に持つ高等動物由来のアシアロ複合型N-結合型糖鎖(Gal)2(GlcNAc)2(Man)3(GlcNAc)2-Asnへも転移効率は低いがピルビン酸を転移できることがわかった。(3)実際に糖タンパク質糖鎖にシアル酸の代わりにピルビン酸が付加されたネオ糖タンパク質の合成を試みた。その結果、少量ではあるがヒトトランスフェリンの糖鎖末端にピルビン酸が付加された糖タンパク質を酵素合成することができた。
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