| 研究課題/領域番号 |
26292109
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
井尻 成保 北海道大学, 水産科学研究科(研究院), 准教授 (90425421)
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| 研究分担者 |
小林 亨 静岡県立大学, 食品栄養科学部, 教授 (30221972)
足立 伸次 北海道大学, 水産科学研究科(研究院), 教授 (40231930)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | ティラピア / 性分化 / アロマターゼ / 濾胞刺激ホルモン / gsdf |
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| 研究実績の概要 |
１、濾胞刺激ホルモン（FSH）の性分化への関与：（１）ティラピアFSH受容体を強制発現させたHEK293細胞に組換えFSHを添加して培養し、cAMP応答配列下に組み込んだルシフェラーゼ活性を測定したところ、100ng/ml添加以降から活性上昇が認められ、200ng/mlでは未添加に比べて12倍以上の極めて強い活性が誘導された。（２）組換えFSHを添加してティラピア精巣片を培養したところ、11-ケトテストステロン産生が上昇する傾向が認められ、加えて培養精巣における11β-水酸化酵素mRNA発現が誘導された。これらのことから、作製したティラピア組換えFSHが強いホルモン作用を有するという確証が得られた。
２、Gsdfの精巣分化誘導機構：アンドロゲンによって誘導されるメダカXX性転換において、Gsdfが誘導された後、Dmrt1発現が誘導されることにより精巣への分化転換が起こることが明らかとなった。この発現順序はXYティラピアの精巣分化時と同様であり、ティラピアとメダカを通した共通する機構であることが示唆された。
３、ティラピア性決定因子の作用解析：ティラピア精巣分化過程においては、amhおよびamhyはいずれもセルトリ細胞系列の細胞ではなく、間充織細胞に特異的に発現することが明らかとなった。amhyが性決定因子であるなら、間充織細胞から精巣分化が制御されるという予想外の結果である。
４、ティラピア超雄偽雌の作出：超雄稚魚は通常エストロゲン処理での雌化誘導が困難であったため、超雄候補稚魚に致死量に近い濃度のエストロゲン処理を施した。生残魚から性特異的DNAマーカーを利用してYY魚を選抜し、飼育を続けた結果、1尾が産卵に至った。本課題において、初めて超雄偽雌が作出されたことが強く期待される。今後、XX雄の精子と掛け合わせることで検定を行い、超雄偽雌であることを確定させる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
１、FSHの性分化への関与：（１）組換えFSHが生物活性を有することが明らかとなり、組換えFSHの稚魚注入実験へ向けての基盤が整った。（２）FSHおよびFSH受容体のノックダウン実験は孵化後8日目稚魚での検定が残されている。また、FSH受容体ノックアウト実験も未だ成功していない。昨年度、卵質の悪化が生じたため顕微注射後の生残が極端に低下したことが停滞している理由である。現在、卵質は改善されたため引き続き顕微注射実験を行うことで、研究計画にある実験の結果が得られると予想される。
２、Gsdfの精巣分化誘導機構：上記と同様の理由で、組換えGsdfの稚魚注入実験およびノックアウト実験が進展していない。改善された卵質の受精卵を用いて引き続き顕微注射実験を行う。
３、ティラピア性決定因子の作用解析：ティラピアの性決定因子として強く示唆されているamhyの発現細胞の同定に成功した。現在、amhyの作用および作用機構解析を進めており、順調に進行している。
４、ティラピア超雄偽雌の作出：超雄偽雌の作出に成功したことが強く示唆される結果が得られ、大きな前進となった。現在行っている検証で超雄偽雌であることが確定すれば、安定的大量超雄魚の生産が可能となる。超雄の養殖産業への利用については、国内では超雄利用を検討していた団体が一時ティラピア養殖を見合わせているため停滞している。海外ではティラピア養殖が盛んな東南アジアの国での利用を提案していく。海外のティラピア養殖ではメチルテストステロン処理により全雄養殖しているため、環境への悪影響が強く懸念される状況にあり、超雄利用により環境に悪影響を与えない全雄生産養殖への転換を目指す。
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| 今後の研究の推進方策 |
ティラピア生殖腺の性分化開始の分子機構の解明を目的に、卵巣分化誘導についてはFSHシグナリングとcyp19a1a発現、E2産生の関係に、精巣分化誘導についてはamhy、GsdfおよびDmrt1の関係、精巣分化抑制についてはFshrとGsdfの関係に焦点を当てて研究を進める。また、超雄偽雌の作出法を確立し、ティラピア養殖における安定的全雄生産システムの完成を実現する。
１、FSHの性分化への関与：（１）ノックダウンに加えて新たにFshrノックアウトティラピアを作製し、ノックダウン魚と同様の結果が得られるかを調べると共に、cyp19a1a、Gsdfおよびhsd17b12L遺伝子発現に対する影響を明らかにする。（２）機能性組換えFSHをXX仔魚に顕微注射し、cyp19a1a、Gsdfおよびhsd17b12L遺伝子発現に及ぼす影響を明らかにする。以上の結果をもとに、FSHの卵巣分化に及ぼす役割の有無を確定する。
２、Gsdfの精巣分化誘導機構：（１）機能性組換えGsdfをXXティラピア仔魚に顕微注射し、Dmrt1およびcyp19a1a発現の変化を調べるとともに、性分化に及ぼす影響を明らかにする。（２）また、未分化XX生殖腺培養に添加し、その形態形成に与える影響を明らかにする。（３）GsdfノックアウトXY魚を作製し、その稚魚に組換えGsdfを注入することで精巣分化が誘導されるかを調べる。
３、ティラピア性決定因子の作用解析：機能性組換えamhおよびamhyを作製し、それらをXX稚魚に注入することで、amhyが性決定因子であるか否かの疑問に決着をつける。また、性分化関連遺伝子発現に及ぼす影響を調べる。
４、引き続き、超雄偽雌の作製を継続し、作出方法を確立する。国内外の共同研究者と協議し、超雄を用いた全雄生産養殖の導入を図る。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ティラピアの卵質悪化による受精卵の生残率低下のため、組換えFSHおよびGSDFの稚魚への注入実験に遅れが生じた。そのため、各組換えタンパク注入後の解析に要する一部の分子生物学的試薬の購入を次年度に繰り越した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度使用額は、in situ hybridizationに必要なプローブ作製用プライマーや発色試薬などの購入に充当する。
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