| 研究実績の概要 |
昨年度までに胎子ウシ羊膜細胞にc-myc, klf4, Oct3/4, SOX2遺伝子をTETプロモータ下に挿入したPiggyBacベクターを導入することによって、継代可能な人工ウシ栄養膜細胞様株の作出を行ったが、本年度はこの細胞株の特質について検討した。以前同様の手法により作出したウシ人工多能性細胞(biPS)株ではDOX存在下でコロニー全体的にアルカリフォスファターゼ活性が確認できた一方で、人工栄養膜細胞株ではDOX存在下であってもアルカリフォスファターゼはコロニー全域に発現は見られず、一部でのみ確認された。次にこの人工栄養膜細胞株における多能性関連および栄養膜関連遺伝子群の発現を免疫組織化学を用いて検討した。栄養膜細胞特異的遺伝子であるCDX2およびIFNTタンパク質の発現が確認されたが、同時にOCT3/4の発現も見られた。しかしながら同じく多能性因子の一つであるNANOGの発現は確認されたものの非常に低いレベルであった。RT-PCRによる解析では人工栄養膜細胞株で栄養膜細胞特異的遺伝子である CDX2、ELF5、ERRβ、IFNtの発現が確認できたが、IFNtの発現は他と比較して低いものであった。
次にDOX非存在下でこの細胞株を２世代継代したところ、細胞の形態は丸石状から上皮状へと変化した。更に小胞形成能を失った。この細胞株の分化能について検討したところ、ES細胞の胚葉体作製方法と同様に細胞を培養したところ、6日間の培養で胚葉体のような組織を形成することはなく、小胞を形成した。更にこの細胞株をDOX非存在下、コラーゲンコートディッシュ上で30日間培養したところ、細胞の形態は変化し、一部の細胞は二核細胞を形成した。この分化した細胞では導入した4種の遺伝子の発現は見られず、その代わりに二核細胞特異的遺伝子であるPL、PRP1、PAG1の発現が確認できた。
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