研究課題/領域番号 |
26292171
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研究機関 | 国立研究開発法人農業生物資源研究所 |
研究代表者 |
金子 浩之 国立研究開発法人農業生物資源研究所, 動物発生分化研究ユニット, 上級研究員 (60343993)
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研究分担者 |
菊地 和弘 国立研究開発法人農業生物資源研究所, 動物発生分化研究ユニット, 上級研究員 (20360456)
中井 美智子 国立研究開発法人農業生物資源研究所, 医用モデルブタ研究開発ユニット, 任期付研究員 (30442825)
大西 彰 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (30414890)
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研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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キーワード | 血友病モデルブタ / 精祖細胞 / 超低温保存 / 異種間移植 / 系統樹立 |
研究実績の概要 |
血友病の治療法開発には、血液凝固系がヒトに近似するブタの血友病モデルが重要な役割を果たす。我々はクローンと組換え技術によって、X染色体上の血液凝固第Ⅷ因子(F8)の遺伝子をノックアウトした血友病モデルブタを開発した。しかし、初代クローンブタが幼若期に失血死したために、成体を用いる従来の繁殖法では後代を得ることができない。本課題では、初代クローン胎子の精巣組織をヌードマウスに移植し、マウス体内で生産された精子を用いて後代を作出することを目的とした。 血友病モデルブタの初代クローン胎子(F8-/Y)の精巣小片を超低温保存し、7匹の去勢したヌードマウスの皮下に15個ずつ移植した。4匹が生存し、移植後300日以降に全採血と精巣組織の回収を行った。精巣組織は3g以上に成長し、細切後精子が回収された。移植前の精巣では精索に最も未分化な生殖細胞:前精祖細胞のみが存在した。回収した精巣組織では精細管の形成が認められ、17%の精細管に精子および30%の精細管に伸長期精子細胞が存在した。マウスの血中インヒビンおよびテストステロン濃度は精巣移植後、著しく上昇した。これらの結果は、組換え血友病モデルブタの胎子精巣はヌードマウス体内で精子生産能と内分泌機能を獲得し得ることを示している。次いで、採取した精子を野生型(F8+/+)の成熟卵に顕微注入して受精卵を作製し、4頭のレシピエントブタの卵管に移植した。2頭のレシピエントブタがそれぞれ、雌1頭と雄1頭、および雌1頭を分娩した。耳介皮膚を用いたPCRとサザンブロッティングによって、雌2頭はF8遺伝子がノックアウトされたX染色体をヘテロにもつ血友病のキャリアーブタ(F8+/-)であることが明らかとなった。一方、雄は野生型(F8-/Y)であった。以上のように、超低温保存、精巣移植および顕微授精を組み合わせて、血友病キャリアーブタを生産することに成功した。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
H27では、血友病モデルブタの初代クローン胎子の精巣を移植したマウスからブタ精子を採取し、この精子を用いて顕微授精卵を作製しレシピエントブタに移植することで、血友病のキャリアーブタ(雌)を2頭生産することに成功した。以上から、本課題は当初の研究計画を達成したものと判断される。
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今後の研究の推進方策 |
H28年度(最終年度)では、H27年度に生産した血友病のキャリアーブタ(F8+/-)を育成し、野生型の雄(F8+/Y)を交配することで、血友病ブタ(雄)を生産できるかを実証する。キャリアーブタ(雌:F8+/-)と野生型の雄(F8+/Y)を交配すると、次世代では、血友病モデルブタ(雄:F8-/Y)が1/4、およびキャリアーブタ(雌:F8-/+)が1/4、正常ブタが1/2の確率で誕生することを実証する。キャリアーブタを後継の雌として維持すれば、野生型の雄を交配することで、継続的な血友病モデルブタの生産が実現される。
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次年度使用額が生じた理由 |
H27で2頭の血友病キャリアーブタの生産に成功したことから、さらなる初代クローン雄の生産、その精巣の超低温保存、およびヌードマウスへの移植を追加して行う必要がなかったため。
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次年度使用額の使用計画 |
H28では、血友病ブタ(雄)およびキャリアーブタ(雌)の末梢血のF8濃度を直接測定できるイムノアッセイを開発する。
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