| 研究課題/領域番号 |
26292182
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
土居 克実 九州大学, (連合)農学研究科(研究院), 講師 (40253520)
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| 研究分担者 |
田代 康介 九州大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (00192170)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 環境 / 応用微生物 / ゲノム / シグナル伝達 / 金属応答 / シリカ / 好熱微生物 |
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| 研究実績の概要 |
Thermus thermophilus HB8及びGeobacillus sp. NBRC 15313をシリカが400 ppm以上過飽和状態で含まれる培地によって70℃、180 rpmで16時間培養後、菌体を除去した培地上清中の溶存シリカ濃度をICP-AESによる発光分光分析によって定量し、上清中に残存したシリカ濃度を培養開始時のシリカ濃度と比較することによって沈殿したシリカ量を測定した。
培養後の残存シリカ濃度は、培地中の初期含有濃度である600ppmから300ppm程度までの減少が確認できたが、菌を含まないコントロール実験においても同程度の減少が見られた。この結果は培地中に存在しているシリカのコロイド粒子が菌体を除く際の遠心分離によって除かれたと考えられた。そのため、上記実験において遠心条件の変更及びフィルター濾過による菌体除去の検討を行った。いずれの方法におけるコントロールでもシリカ濃度の減少が確認され、菌体除去の方法がシリカ濃度の減少を引き起こす原因ではないと考えられた。
また、シリカ誘導性タンパク質Sipの誘導と類似のメカニズムを大腸菌に発見し、その利用を試みた。シリカ添加による鉄濃度依存的な転写制御タンパク質Fur制御下にある遺伝子の転写誘導が大腸菌においても確認された。そこで、様々なプロモーターとFur Boxを組み合わせた発現系を構築したところ、最も転写増大したfhuAプロモーターを用いた発現系は、十分なタンパク質の発現が見られず、T5プロモーターを用いた発現系では、シリカ誘導は確認できたものの、基底レベルでの発現量が大きく、これらの系は不適であると判断した。そこで、lacプロモーターを用いた発現系では、シリカ誘導により発現量の増加が確認され、シリカを誘導剤として用いることができ、鉄のキレート剤を用いるよりもシリカを用いたほうが発現量が増大した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初計画していた次世代シークエンサーの導入に際し、いくつかの機種で目的とする実験が行われるかどうかを事前にチェックしたが、思うような結果が出ず、購入できていないため、実験に若干遅れが生じている。しかし、本年3月に新たなキットが試作され、それを試したところ、一定以上の良好な結果が得られたことから、本キットを用いることで研究の飛躍的な進展が見られそうであることが期待できた。現在、次世代シークエンサーの購入と新製品キット（発売は今年度初旬予定）の購入を急いでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
シリカ沈殿メカニズムの解明について、今後はシリカ沈殿を引き起こす要因を特定するために、培地成分を対象とした解析を行う予定である。
また、plac-Fur発現系はシリカを誘導剤とする発現系として利用可能であるほか、Fur Boxによる厳しい制御により、leakyな発現を大きく抑えることができるため、毒性タンパク質の発現ベクターとして利用可能であると判断し、現在、大腸菌の溶菌酵素等を同上システムで発現検討している。
今年度は、誘導条件の検討やSD配列などの改良によるさらなる発現系の改変、さらにSi-Tagと併用することによる発現・精製の最適化などといったより実用性の高い発現系の開発に取り組んでいくことで、発現系としての有用性を考察すること、また、今回用いた知見を好熱菌に応用することで、好熱菌の発現ベクターの作製も可能になると考えられる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
購入申請した次世代シークエンサーを購入するため、各機種のデモを依頼したが、要求するスペックを満たすものが見つからず、メーカーとのやり取りを継続しているため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
現在、試薬等を改良した次世代シークエンサーおよび試料調製機を用いたデモを行っており、この結果が良好であれば、購入する予定である。しかし、結果が不良の際には、次世代シークエンサーを用いた解析を専門業者に依頼するための費用とする予定である。
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