| 研究課題/領域番号 |
26292189
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
谷本 啓司 筑波大学, 生命環境系, 教授 (90261776)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ゲノム / 発現制御 / エピジェネティクス / ゲノム刷り込み |
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| 研究実績の概要 |
１．我々がトランスジェニックマウスを用いて新奇に発見した、H19-ICR配列の受精後刷り込みメチル化について、その反応が起こる時期を詳細に解析した。父親に由来するトランスジェニックH19-ICR配列のメチル化状態を、１細胞期や２細胞期胚を用いて解析した結果、受精後のごく早い時期にメチル化が開始することを明らかにできた。
２．マウス刷り込み遺伝子座のH19-ICR配列のメチル化は、精子生殖細胞においてはDNAメチル化酵素（DNA methyl-transferase ）、Dnmt3aとDnmt3Lにより触媒される。一方、トランスジェニックマウスの初期胚（1細胞期胚～）におけるH19-ICR配列の刷り込みメチル化反応については、精子からのこれら酵素の持ち込みは期待できない。そこで、卵から持ち込まれるmaternalな酵素を遺伝学的にノックアウトすることで、責任触媒酵素を明らかにすることとした。具体的には、Dnmt酵素群の遺伝子を全身で欠損するコンベンショナル・ノックアウト（KO）マウス、あるいは、Zp3-Cre TgM（卵特異的発現を示す）を用いることで、これら遺伝子を卵のみで欠損するコンディショナル・KOマウスを準備した。次に、これらノックアウト・マウスに対して、交配により、野性型H19-ICRを保持する酵母人工染色体（YAC）遺伝子座を導入し、そのメチル化解析をおこなった。その結果、受精後刷り込みメチル化に必須の母親由来酵素を明らかにすることができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の研究計画、あるいは、年度初めの研究実施計画に記した研究目的を順調に遂行し、期待の成果を得ることが出来たため。論文公表も視野に入れたい。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後も、当初研究計画に記述したとおりに研究を遂行する。平成27年度については、受精後刷り込みメチル化に必須の領域を、2.9 kbの H19-ICR配列内に探索するための準備をおこなう。具体的には、H19-ICR配列の欠失変異体を多数（10系統以上）作製し、それぞれについて酵母での相同組換え反応によりヒト・βグロビン酵母人工染色体（YAC）へ挿入する。同YACをマウス受精卵へ顕微注入することでトランスジェニックマウスを作製する。パルスフィールドゲル電気泳動などを用いて、YACの構造が無傷であることを確認する。H19-ICR断片をYACに挿入する理由は、同断片をトランスジーンに付随する問題である「位置効果」から保護するためである。また、導入DNA断片のサイズが大きいため、1コピーの系統を比較的容易に得られるという利点もある。得られたマウスのメチル化解析をおこなう。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初依頼を予定していた、筑波大学生命科学動物資源センターにおけるマウス胚操作（トランスジェニックマウスの作成と受精卵の凍結）のうち、前者の一部については、センターの請負可能時期と我々の実験とのタイミングが合わず、急遽、独自に胚操作を行ったため、予算の使用が少なくてすんだ。後者については、生存状態にて継代維持しているが、遺伝子改変マウス系統維持のための受精卵凍結保存はいつまでも先送りすることは出来ないため、次年度での実施を予定している。
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| 次年度使用額の使用計画 |
前述のように、現在、平成26年度に予定していたマウス受精卵の凍結保存の依頼を先延ばしにした状態になっている。繰り越し分の予算は、同依頼に使用するとともに、マウスのハンドリングができる技術者の短期雇用に充当することも視野に入れている。
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