| 研究課題/領域番号 |
26292189
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
谷本 啓司 筑波大学, 生命環境系, 教授 (90261776)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ゲノム / 発現制御 / エピジェネティクス / ゲノム刷り込み / DNAメチル化 |
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| 研究実績の概要 |
H27年度までに、本来 DNA メチル化刷り込みを受けない λ ファージDNA 断片（CpG配列に富む）に対して、インスレータータンパク質 CTCF の結合配列を４カ所、さらに細胞に対して多能性を与える転写因子、Oct の結合配列を付加した断片を調製し、 LCb（lambda+CTCF+b）と命名した。同断片を用いてトランスジェニック・マウスを作成し、in vivo で DNA メチル化刷り込みを受けないことを明らかにした。受精後刷り込みメチル化に必要な配列を in vivo（YAC トランスジェニック・マウス）で同定し、PODS と命名した。これを、LCb 配列に付加した断片 （LCb+PODS） を用いて、YAC トランスジェニック・マウスを作製した（再構築系）。その結果、同配列が DMR (differentially methylated region) として機能することが分かった。
そこでH28年度は、
1. 内在 H19-ICR の機能を LCb+PODS 配列により代替できるのかについて（つまり、十分性の）検証をおこなうため、ES 細胞で、ゲノム編集による内在 H19-ICR の置換を行った。さらに、集合法によりマウス個体を作出した。同断片の DNA メチル化解析（Southern blot、及び、Bisulfite sequencing 解析）を、一部開始した。
2. ゲノム編集により、内在PODS配列の欠失を行った（一部、RNA エレクトロポレーション法を使用）。
3. PODS 配列に結合し、DMR の機能を担う因子を同定するため、ゲルシフトアッセイや酵母one-hybrid systemによるクローニングを開始した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
年度始めの当初計画内容を順調に遂行し、次年度に予定していた内容（結合因子の探索）についても着手することができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究計画の変更はなく、その遂行上の問題点は見当たらない。今後も、当初の計画通りに研究を遂行する。我々はこれまで、新規に見いだしたDNA配列機能の十分性に加え、その十分性の見地からの検証も開始した。今後は、人工的に再構築したDNA配列を内在遺伝子座の相当配列と置換する、あるいは、PODS配列を内在遺伝子座から欠失させることで、その生物学的重要性を明らかにする。また、ゲノム刷り込みの分子メカニズム解明のため、複数の手法を採用することにより、関与する分子の探索をおこなう。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初、筑波大学生命科学動物資源センターへの依頼を予定していた、遺伝子改変マウスの作製を、CRISPR/Cas9ゲノム編集法を独自に立ち上げることで、自前にて行えたことによる必要経費の減少による。
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| 次年度使用額の使用計画 |
新規分子の探索のために、大規模細胞培養と質量分析解析、及び、候補分子の解析のために、まとまった種類の抗体の購入を予定している。また、CRISPR/Cas9ゲノム編集で作製中のマウス系統の中には、組み換え領域が巨大なためか、作製できていないものがある。このため、ES細胞集合胚キメラ法により作製をおこなうことを考えており、前年度分の経費の減少分は、これらに使用したい。
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