個別化医療に向けた抗体医薬品の標的分子の糖鎖構造と薬効・体内動態の関係の解明

2015 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 26293037
• 研究機関: 横浜市立大学
• 研究代表者: 川崎 ナナ 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 教授 (20186167)
• 研究分担者: 小川 久美子 国立医薬品食品衛生研究所, 病理部, 部長 (70254282)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 個別化医療 / 抗体医薬品 / 糖鎖 / 薬効 / 体内動態

研究実績の概要

抗体医薬品の薬効発現には標的分子との結合が関与しており，これら標的分子の多くは糖タンパク質である．本研究の目的は，これら標的分子の糖鎖の多様性と薬効発現の関係を明らかにすることであり、特に抗EGFR抗体とEGFRに着目している．今年度は主に以下の成果が得られた．
１．糖ペプチドの選択的回収法の最適化
質量分析でEGFRの糖鎖構造を解析するために，我々が独自開発したアセトンを用いた糖ペプチドの選択的回収法が界面活性剤存在下でも利用可能かどうか，LC/MS/MSでその適用性を評価した．その結果，添加されたSDSやSDC等の界面活性剤は，ペプチドと共に上清成分として除去されることが明らかとなり，本手法のEGFR糖鎖構造解析への適用性が示された．
２．EGFR糖鎖の分子多様性および不均一性の解明
昨年度，認識ドメインの異なる２種の抗EGFR抗体を用いて，抗体との結合性が異なるEGFR分子が存在する可能性を見出し、分子量の違いから、糖鎖が異なっていることが示唆された．本年度はまず，EGFRの細胞外ドメインを認識するセツキシマブに非反応性の約170-kDa成分について，LC/MS/MSによる同定を試みた．その結果，筆頭タンパク質としてEGFRが同定され，抗体との結合性が異なるEGFRが存在することが確認された。並行して，LC/MS/MSによりEGFRの糖鎖構造解析を検討し、細胞外ドメインを認識するセツキシマブ反応性EGFRのドメイン３および４に存在する８ヵ所のN-糖鎖結合コンセンサス配列のうち，５ヵ所に結合している糖鎖の不均一性を明らかにすることに成功した．

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究の目的は，抗体医薬品の標的分子の糖鎖構造を解析し，その構造多様性と薬効発現との関連性を明らかにすることである．微量膜タンパク質であるEGFRの糖鎖構造を解析するために，本年度はまず，我々が独自に開発した糖ペプチドの選択的回収法が，界面活性剤存在下でも利用可能であることを示した．また，昨年度に確立したEGFRの単離法と本法を用いることにより，主にセツキシマブとの結合領域であり，EGFとの結合に伴う膜上糖脂質との相互作用領域とされるEGFRのドメイン３および４の配列上に推定されている８ヵ所のN-糖鎖結合部位のうち，５ヵ所の糖鎖不均一性を明らかにすることに成功した．これらのうち，Asn528およびAsn603には不均一性が高く特徴的な糖鎖が結合していることが推定された． 本年度までに，既に当初の研究計画目標であったEGFR糖鎖の構造特性を一部明らかにすることができた．また，抗体との結合性の異なる他のEGFR分子種を同定できたことから，研究はおおむね順調に進展している．

今後の研究の推進方策

平成２８年度においては， 引き続きEGFR高発現癌細胞株であるA431（ヒト上皮様細胞癌由来細胞株）を用いて，セツキシマブ結合性/非結合性EGFR糖鎖構造の全容解明を目指す．糖鎖構造解析にあたっては，今年度までに確立したEGFRの単離法・試料調製法を用いる．抗体との結合性の異なるEGFR分子の糖鎖不均一性を部位ごとに比較することで，糖鎖構造と抗体医薬品の薬効発現との関係を考察する予定である．

次年度使用額が生じた理由

細胞由来サンプルを分析するため,ナノLC/MS/MSシステムへの影響を考慮し,ナノカラム及びスプレーチップ等の消耗品を多めに計上していたが、本研究遂行中に免疫沈降法とアセトン沈降法組み合わせることにより,目的とする糖タンパク質由来糖ペプチドを選択的に濃縮する方法を開発することができたため,カラムやスプレーチップの消耗を抑えることができたため,次年度使用額が生じた.

次年度使用額の使用計画

本研究遂行のため,次年度使用額を研究員の雇用に使用する.

研究成果

• [雑誌論文] Membrane glycoproteomics of fetal lung fibroblasts using LC/MS. (2016)
  • 著者名/発表者名: Takakura D, Tada M, Kawasaki N
  • 雑誌名: Proteomics 巻: 16 ページ: 47-59
  • DOI: 10.1002/pmic.201500003
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Comparison of analytical methods for profiling N- and O-linked glycans from cultured cell lines. HUPO Human Disease Glycomics/Proteome Initiative multi-institutional study. (2015)
  • 著者名/発表者名: Ito H,Kaji H,Togayachi A,Azadi P,Ishihara M,Geyer R, Galuska C,Geyer H,Kakehi K,Kinoshita M,Karlsson NG,Jin C,Kato K,Yagi H,Kondo S,Kawasaki N,Hashii N,Kolarich D,Stavenhagen K,Packer NH,Thaysen-Andersen M,Nakano M,Taniguchi N,Kurimoto A,Wada Y,Tajiri M,Yang P,Cao W,Li H,Rudd PM,Narimatsu H.
  • 雑誌名: Glycoconjugate J 巻: Oct 28 ページ: in press
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 膜グライコミクス技術の確立 (2015)
  • 著者名/発表者名: 高倉大輔，川崎ナナ
  • 学会等名: 糖質学会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2015-07-31 – 2015-08-02
• [学会発表] 糖タンパク質分析技術の開発 (2015)
  • 著者名/発表者名: 川崎ナナ，高倉大輔
  • 学会等名: 日本プロテオーム学会
  • 発表場所: 熊本
  • 年月日: 2015-07-23 – 2015-07-24
  • 招待講演