| 研究課題/領域番号 |
26293064
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
篠原 美都 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10372591)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 幹細胞 / 生殖 / 自己複製 / 細胞周期 |
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| 研究実績の概要 |
本研究ではCDK inhibitor p57が精子幹細胞活性の維持に果たす役割を明らかにするため、p57遺伝子の欠損または過剰発現が、精子幹細胞の活性を左右する要因である増殖能・ホーミング活性・接着性・自己複製維持のどの点に影響を及ぼすかを、conditional knockout マウスや精子幹細胞培養系を用い、in vitro とin vitroの両面から解析することを目的としている。２６年度の研究では以下の実験を行った。
（１）p57-CKOマウスの精子幹細胞の移植アッセイ：p57-CKOマウスをR26Rマウスと交配し、ホモ個体より精巣細胞を採取し、Cre recombinase を発現するアデノウイルス（AxCAN-Cre）にて試験管内で感染させた後、細胞を回収しWマウスの精巣に移植した。移植後２ヶ月でホスト精巣を摘出し、 LacZ染色により観察したところ、p57 遺伝子deletionによりコロニー数の低下が見られた。（２）p57-CKOマウスからのGS細胞の樹立：p57-CKOマウスのホモ個体精巣から常法に従って精子幹細胞培養株（GS細胞）を樹立した。（３）p57 欠損 GS細胞の表現型／機能解析：p57-CKO GS細胞を試験管内でAxCAN-Creに感染させ、deletionによる影響を調べた。増殖速度、細胞外基質Lamininへの接着性・RT-PCRやフローサイトメトリーによる精子幹細胞マーカーの発現を調べた。p57遺伝子deletionによりアポトーシスの亢進が見られた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
動物の飼育施設にて感染があり、一時的にマウスの飼育を縮小することを余儀なくされたため、p57 conditional KOマウスの繁殖効率が低下した。そのためp57-CKOマウスの精子幹細胞の移植アッセイ実験が十分な実験数行えず、次年度に追加実験を行うこととした。それ以外の実験計画に関しては、おおむね予定通り進行している。
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| 今後の研究の推進方策 |
①精子幹細胞におけるp57遺伝子の発現を制御するメカニズムを明らかにするため、FGF2やGDNF等の精子幹細胞の自己複製因子がp57遺伝子発現に及ぼす影響を調べる。また②p57発現が自己複製シグナル経路のどの部分に関与しているかを明らかにするため、これまでに精子幹細胞の自己複製制御との関わりが示唆されてきたシグナル伝達経路(AKT, MAP2K1, JNK, ROS, など)を重点的に、阻害剤を用いて調べる。また上流遺伝子については③自己複製維持に関与することが知られている分子群のshRNA libraryをGS細胞に導入し、p57遺伝子の発現に影響するものをスクリーニングする。一方、P57遺伝子の下流ターゲットについても④p57ノックアウトマウスから樹立したGS細胞で発現する遺伝子をマイクロアレイ解析により明らかにする。また、平成２６年度に十分な実験数が得られなかったp57-CKOマウスの精子幹細胞の移植アッセイについては、追加実験を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
動物の飼育施設にて感染があり、一時的にマウスの飼育を縮小することを余儀なくされたため、p57 conditional KOマウスの繁殖効率が低下した。そのためp57-CKOマウスの精子幹細胞の移植アッセイ実験が十分な実験数行うことができなかった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
p57-CKOマウスの精子幹細胞の移植アッセイ実験については、平成２６年度に十分な実験数が得られなかったので、平成２７年度に追加実験を行う予定であり、未使用分の経費は平成２７年に使用する。
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