バクテリアべん毛輸送装置のエネルギー変換システムの分子基盤

2016 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 26293097
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 南野 徹 大阪大学, 生命機能研究科, 准教授 (20402993)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 細菌 / 遺伝学 / 蛋白質 / 一分子計測（SMD) / 感染症

研究実績の概要

本研究では、光学顕微ナノ計測装置を活用し、遺伝的および生化学的手法を組み合わせることで、ATPおよび細胞膜を横切るイオン駆動力を動力源とするべん毛蛋白質輸送装置のエネルギー変換の分子機構の解明することを目指している。本年度の主な成果は以下に示す。
1. 蛍光イメージング法によりべん毛繊維の成長速度を定量的に解析した結果、べん毛繊維の形成初期は1分間に100 nm伸長すること、その後べん毛繊維が長くなるに伴って、べん毛繊維の伸長速度が20 nm/minにまで低下することを見出した。
2. pH感受性蛍光蛋白質を輸送装置の近傍に標識して局所pH計測を行った結果、わずか1μmほどのバクテリア細胞内でpH勾配が形成されていること、さらに、べん毛蛋白質輸送装置がATP加水分解とプロトン駆動力をカップルさせて利用することで効率的な蛋白質輸送を行っていることを明らかにした。
3. 膜電位を上昇させると、水素イオンやナトリウムイオンの濃度勾配が消失しても、べん毛蛋白質が輸送されることが判明した。
4. FlhAのC末細胞質ドメイン（FlhAc）がClosed formからOpen formへと構造変化すること、さらにFlhAの膜貫通ドメインとFlhAcをつなぐリンカー領域がすぐ隣の別のFlhAcサブユニットの構造変化を誘導することを見出した。さらに、このFlhAcサブユニットの協調的な構造変化はATPase複合体に依存することが示唆された。
5. FlhBがFli6FliR2複合体に結合することを見出した。さらに、FliO/FliP/FliQ/FliR/FlhA/FlhB複合体やFlhAが結合したMSリング複合体の単離精製に成功した。

現在までの達成度 (段落)

28年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

28年度が最終年度であるため、記入しない。

次年度使用額が生じた理由

28年度が最終年度であるため、記入しない。

次年度使用額の使用計画

28年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [国際共同研究] ニューキャスル大学(英国)
  • 国名: 英国
  • 外国機関名: ニューキャスル大学
• [国際共同研究] ヘルムホルツ感染研究センター(ドイツ)
  • 国名: ドイツ
  • 外国機関名: ヘルムホルツ感染研究センター
• [雑誌論文] Bacterial intracellular sodium ion measurement using CoroNa Green. (2017)
  • 著者名/発表者名: Morimoto, Y.V., Namba, K., Minamino, T.
  • 雑誌名: Bio-protocol 巻: 7 ページ: e2092
  • DOI: 10.21769/BioProtoc.2092
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Measurements of free-swimming speed of motile Salmonella cells in liquid media. (2017)
  • 著者名/発表者名: Morimoto, Y.V., Namba, K., Minamino, T.
  • 雑誌名: Bio-protocol 巻: 7 ページ: e2093
  • DOI: 10.21769/BioProtoc.2093
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Bacterial flagella grow through an injection-diffusion mechanism. (2017)
  • 著者名/発表者名: Renault, T.T., Abraham, A.O., Bergmiller, T., Parados, G., Rainville, S., Charpentier, E., Guet, C.C., Tu, Y., Namba, K., Keener, J.P., Minamino, T., Erhardt, M.
  • 雑誌名: eLife 巻: 6 ページ: e23136
  • DOI: 10.7554/eLife.23136
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Fuel of the bacterial flagellar type III export apparatus. (2017)
  • 著者名/発表者名: Minamino, T., Kinoshita, M., Namba, K.
  • 雑誌名: Methods Mol. Biol. 巻: 1593 ページ: 3-16
  • DOI: 10.1007/978-1-4939-6927-2_1
  • 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Stoichiometry and turnover of the stator and rotor. (2017)
  • 著者名/発表者名: Morimoto, Y.V., Minamino, T.
  • 雑誌名: Methods Mol. Biol. 巻: 1593 ページ: 203-213
  • DOI: 10.1007/978-1-4939-6927-2_16
  • 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Rearrangements of α-helical structures of FlgN chaperone control the binding affinity for its cognate substrates during flagellar type III export. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kinoshita, M., Nakanishi, Y., Furukawa, Y., Namba, K., Imada, K., Minamino, T.
  • 雑誌名: Mol. Microbiol. 巻: 101 ページ: 656-670
  • DOI: 10.1111/mmi.13415
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Structural stability of flagellin subunit affects the rate of flagellin export in the absence of FliS chaperone. (2016)
  • 著者名/発表者名: Furukawa, Y., Inoue, Y., Sakaguchi, A., Mori, Y., Fukumura, T., Miyata, T., Namba, K., Minamino, T.
  • 雑誌名: Mol. Microbiol. 巻: 102 ページ: 405-416
  • DOI: 10.1111/mmi.13469
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] High-resolution pH imaging of living bacterial cell to detect local pH differences. (2016)
  • 著者名/発表者名: Morimoto, Y.V., Kami-ike, N., Miyata, T., Kawamoto, A., Kato, T., Namba, K., Minamino, T.
  • 雑誌名: mBio 巻: 7 ページ: e01911-16
  • DOI: 10.1128/mBio.01911-16
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [学会発表] べん毛III型輸送装置構成蛋白質FliJとIII型輸送シャペロンとの相互作用 (Role of interactions of FliJ with FlgN and FliT chaperones in flagellar type III protein export). (2017)
  • 著者名/発表者名: 南野徹, 木下実紀, 森本雄祐, 難波啓一.
  • 学会等名: 第90回日本細菌学会総会
  • 発表場所: 仙台国際センター展示棟（宮城県仙台市）
  • 年月日: 2017-03-19 – 2017-03-20
• [学会発表] Cooperative remodeling of the FlhA ring structure coordinates flagella type III protein export with assembly. (2017)
  • 著者名/発表者名: Minamino, T.
  • 学会等名: OIST Workshop “Bacterial flagella, injectisomes & type III secretion systems” joint with Annual Flagella Meeting
  • 発表場所: OIST, Kunigami-gun, Okinawa
  • 年月日: 2017-03-02
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Conformational rearrangement of FlhA is critical for flagellar type III protein export. (2017)
  • 著者名/発表者名: Inoue, Y., Kinoshita, M., Kitano, A., Imada, K., Namba, K., Minamino, T.
  • 学会等名: OIST Workshop “Bacterial flagella, injectisomes & type III secretion systems” joint with Annual Flagella Meeting
  • 発表場所: OIST, Kunigami-gun, Okinawa
  • 年月日: 2017-03-01
  • 国際学会
• [学会発表] Role of intrinsically disordered region of the C-terminal domain of FliK in substrate specificity switching of the bacterial flagellar type III export apparatus. (2017)
  • 著者名/発表者名: Kinoshita, M., Aizawa, S., Namba, K., Minamino, T.
  • 学会等名: OIST Workshop “Bacterial flagella, injectisomes & type III secretion systems” joint with Annual Flagella Meeting
  • 発表場所: OIST, Kunigami-gun, Okinawa
  • 年月日: 2017-03-01
  • 国際学会
• [学会発表] In Vitro reconstitution of the protein export of the flagellar typeIII secretion system by using the inverted membrane vesicles. (2017)
  • 著者名/発表者名: Terashima, H., Kawamoto, A., Tatsumi, C., Namba, K., Minamino, T., Imada, K.
  • 学会等名: OIST Workshop “Bacterial flagella, injectisomes & type III secretion systems” joint with Annual Flagella Meeting
  • 発表場所: OIST, Kunigami-gun, Okinawa
  • 年月日: 2017-03-01
  • 国際学会
• [学会発表] 蛍光ラベルした細菌べん毛蛋白質のin vitro輸送測定系を用いた検出. (2016)
  • 著者名/発表者名: 戸野侃, 寺島浩行, 巽千夏, 川本晃大, 田端和仁, 上野博史, 松田知己, 永井健治, 野地博行, 難波啓一, 南野徹, 今田勝巳.
  • 学会等名: 日本生体エネルギー研究会第42回討論会
  • 発表場所: 名古屋工業大学（愛知県名古屋市）
  • 年月日: 2016-12-20
• [学会発表] 蛋白質膜透過を駆動するモータータンパク質のスナップショット. Snapshots of a protein translocation motor. (2016)
  • 著者名/発表者名: Furukawa, A., Yoshikaie, K., Mori, T., Mori, H., Morimoto, Y., Sugano, Y., Iwaki, S., Minamino, T., Sugita, Y., Tanaka, Y., Tsukazaki, T.
  • 学会等名: 第54回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: つくば国際会議場（茨城県つくば市）
  • 年月日: 2016-11-27
• [学会発表] FlhAの構造変換がべん毛蛋白質輸送順序の決定に重要である. Conformational rearrangements of FlhA is critical for ordered protein export during flagellar assembly. (2016)
  • 著者名/発表者名: Inoue, Y., Ogawa, Y., Kinoshita, M., Imada, K., Namba, K., Minamino, T.
  • 学会等名: 第54回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: つくば国際会議場（茨城県つくば市）
  • 年月日: 2016-11-27
• [学会発表] 細菌べん毛III型タンパク質輸送のin vitro再構築. In vitro reconstitution of the bacterial flagellar type III protein export. (2016)
  • 著者名/発表者名: Terashima, H., Kawamoto, A., Tatsumi, C., Namba, K., Minamino, T., Imada, K.
  • 学会等名: 第54回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: つくば国際会議場（茨城県つくば市）
  • 年月日: 2016-11-27
• [学会発表] バクテリアべん毛輸送ゲート複合体の発現系の構築と精製. (2016)
  • 著者名/発表者名: Fukumura, T., Kinoshita, M., Namba, K., Minamino, T.
  • 学会等名: 第54回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: つくば国際会議場（茨城県つくば市）
  • 年月日: 2016-11-27
• [学会発表] 反転膜小胞を用いたべん毛軸構造タンパク質よ輸送順序の解析. Secretion order of the Class-II flagellar axial proteins analyzed by inverted membrane vesicles(IMV). (2016)
  • 著者名/発表者名: Matsumoto, Y., Tatsumi, C., Terashima, H., Minamino, T., Imada, K.
  • 学会等名: 第54回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: つくば国際会議場（茨城県つくば市）
  • 年月日: 2016-11-26
• [学会発表] Direct observation of ring formation of the C-terminal cytoplasmic domain of a flagellar type III export gate protein FlhA by high-speed atomic force microscopy. (2016)
  • 著者名/発表者名: Minamino, T., Terahara, N., Inoue, Y., Kodera, N., Ando, T., Namba, K.
  • 学会等名: 4th Kanazawa Bio-AFM Workshop 2016
  • 発表場所: KKR ホテル金沢（石川県金沢市）
  • 年月日: 2016-10-05
  • 国際学会
• [学会発表] バクテリアべん毛モーターの動的機能構造を支える分子基盤. (2016)
  • 著者名/発表者名: 南野徹.
  • 学会等名: 蛋白研セミナー・第6回分子モーター討論会
  • 発表場所: 大阪大学蛋白質研究所（大阪府吹田市）
  • 年月日: 2016-07-25
  • 招待講演
• [学会発表] バクテリアべん毛III型輸送システムの機能と構造. (2016)
  • 著者名/発表者名: 南野徹.
  • 学会等名: 大阪大学微生物病研究所セミナー
  • 発表場所: 大阪大学微生物病研究所（大阪府吹田市）
  • 年月日: 2016-07-05
  • 招待講演
• [学会発表] 蛋白質輸送体の中に存在する、回転分子モーターによく似た複合体. Protein translocator resembling the FI-rotary motor. (2016)
  • 著者名/発表者名: 寺島浩行, 川元晃大, 巽千夏, 難波啓一, 南野徹, 今田勝巳.
  • 学会等名: 第16回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: 福岡国際会議場（福岡県福岡市）
  • 年月日: 2016-06-09
• [学会発表] バクテリアべん毛フックの長さ制御におけるFlhAとFliH/FliI複合体の役割. (2016)
  • 著者名/発表者名: 井上由美, 木下実紀, 難波啓一, 南野徹.
  • 学会等名: 第13回21世紀大腸菌研究会
  • 発表場所: グリーンピア南阿蘇（熊本県阿蘇郡）
  • 年月日: 2016-06-02
• [学会発表] バクテリアべん毛フック長制御蛋白質FliKの部位特異的in vivo光架橋実験. (2016)
  • 著者名/発表者名: 木下実紀, 難波啓一, 南野徹.
  • 学会等名: 第13回21世紀大腸菌研究会
  • 発表場所: グリーンピア南阿蘇（熊本県阿蘇郡）
  • 年月日: 2016-06-02
• [学会発表] Energy transduction mechanism of bacterial flagellar type III protein export. (2016)
  • 著者名/発表者名: Minamino, T.
  • 学会等名: Type III secretion systems 2016
  • 発表場所: Tubingen, Germany
  • 年月日: 2016-04-04
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Flagellar type III protein export in Salmonella and the roles of chaperones. (2016)
  • 著者名/発表者名: Minamino, T.
  • 学会等名: Joint SFB 900 and IRTG 1273 Seminar Series
  • 発表場所: Hannover Medical School, Hannover, Germany
  • 年月日: 2016-04-01
  • 招待講演
• [備考]
  • URL: http://www.fbs.osaka-u.ac.jp/jpn/general/lab/02/result/