研究課題
胸腺内でのCD4+CD8+DP胸腺細胞のヘルパー/キラー系列決定機構の解明は、免疫学の重要な課題の一つであり、これまでにThpok遺伝子の発現の有無がこの機構の中心的制御であることが示されている。研究代表者はこれまでThpok遺伝子発現制御機構を精力的に明らかにしており、先行的な研究結果からThpok遺伝子座での局所クロマチン構造変化がThpok遺伝子発現の分子スイッチとして重要である知見を得た。本研究課題では、Bcl11b転写因子やクロマチン構造修飾因子SATB1を中心にThpok遺伝子座の局所クロマチン構造変換を介したThpok遺伝子制機構を明らかにすることを目的とする。本年度の成果として、局所クロマチン構造解析の新規技術であるinsertion ChIP(iChIP)法や遺伝子改変マウスを用いることにより、Bcl11b転写因子のC末端配列を介したThpok遺伝子のT細胞系列型への構造変換がTCR信号下流でのThpok遺伝子発現制御機構に必須である知見を得た。次にこのようなBcl11bを介した制御がFoxP3遺伝子やRunx3遺伝子の発現制御にも関与することを明らかにした。次にSATB1はThpok遺伝子座内の近位エンハンサーの活性化に必須であり、SATB1の欠損により正常のヘルパーT細胞分化が障害されることを明らかにした。SATB1はその他にもCd4/Cd8遺伝子、Runx3遺伝子及び FoxP3遺伝子のエンハンサーに結合し、その活性化に必要である知見も得た。
1: 当初の計画以上に進展している
Thpok遺伝子座内のサイレンサー及び近位エンハンサー領域の2点からのiChIP法の施行により10kbの至近距離でのゲノム領域相互作用を計測することで、Thpok遺伝子座では系列特異的なクロマチ構造が形成される知見を得た。また機能減弱を示すBcl11b変異マウスの解析からBcl11b転写因子のC末端配列が限られた標的遺伝子座での局所クロマチン構造変化に関与する結果を得た。このBcl11bを介したクロマチン構造変化は他の転写因子の結合に影響するというよりも、ゲノム領域間の相互作用を制御すると考えられた。またSATB1が当初予想していたよりもよりグローバルに多くの遺伝子を制御することが明らかとなった。以上の結果から、T細胞分化制御機構においてBcl11bやSATB1を介したクロマチン構造変換という新規階層での制御機構の重要性という新たなパラダイムを提示できたことは、この領域を牽引する国際的に高く評価される成果であり、当初の予想以上のものである。
本年度はiChIP法による局所クロマチン構造計測、Bcl11b及びSATB1の機能解析に関して、これまでの成果を論文発表することが最優先である。また今後の研究については、SATB1変異マウスではゲノム領域の相互作用に関してどのような異常が生じているのかゲノムワイドに検索するため4C及びHi-Cアッセイの系を立ち上げることが重要と感じている。またThpok遺伝子発現制御におけるBcl11bの機能にはリン酸化やSUMO化といった翻訳後修飾よりもC末端配列が重要である知見を得たことから、C末端配列に会合する分子の同定を重要課題に位置づける。その為に機能的な最小限のC末端配列の同定を行い酵母でのTwo-hybird法を試すとともに、野生型と変異型のBcl11bタンパクを用いて会合分子の差異を質量分析法にて検索する方法を考慮する。これまでに生体内でビオチンあるいはOST配列によりBcl11bタンパクを標識できるマウスを作製しているので、ChIP法や会合分子の同定にはどちらの標識が優れているか見極め、変異Bcl11タンパク及びSATB1タンパクにおいても同様の標識を行えるマウスを作製する。
本年度(H26年度)のBcl11b変異マウスの表現型解析の結果、Bcl11bのC末端配列と会合する分子の同定が重要となり、その為に次年度(H27年度)には新たに遺伝子改変マウスの作製を計画することとなった。同様にクロマチン構造変換におけるSATB1の重要性が明らかとなり、SATB1の機能解析や作用機序の解明に向けて次年度には新たにSATB1遺伝子改変マウスの作製が必要と考えた。一方SATB1やBcl11b変異マウスのバックグラウンドで次世代シークエンサーを用いたゲノム領域間相互作用の網羅的計測(4C或はHI-C)を計画しているが、本年度ではマウスの交配に遅れが生じこの実験の使用に適したマウスの作製が遅延したことから、これらの実験は次年度に実施する計画となった。新規遺伝子改変マウス系統の作製や次世代シークエンサーを用いた解析は実験単価が高額となることから、それらの費用を担保する目的で予算を次年度に繰り越すこととした。
以下の2項目が次年度使用額の主な使用計画である。1).Bcl11bのC末端配列と会合する分子の同定の目的の為にC末端を欠損するBcl11b変異タンパクに生体内でビオチン標識が可能な遺伝子改変マウスの作製、及びSATB1の機能解析や作用機序の解明に向けてSATB1タンパクにGFP標識及びビオチン標識を付加したマウスの作製費用に充てる。2.) SATB1やBcl11b欠損によるゲノム領域間相互作用の変化を4CやHi-C法、或は我々独自のiChIP法により網羅的に計測する為には次世代シークエンサーを用いた計測が必要であり、その費用に充てる。
すべて 2015 2014
すべて 雑誌論文 (10件) (うち査読あり 9件、 オープンアクセス 3件) 学会発表 (10件) (うち招待講演 8件)
J. Leukoc. Biol.
巻: 97 ページ: 635-44
10.1189/jlb.1HI1113-597RR
J.Exp.Med.
巻: 212 ページ: 107-20
10.1084/jem.20141479
Nat Commun.
巻: 5 ページ: 5872
10.1038/ncomms6872
Dev Dyn.
巻: 244 ページ: 488-96
10.1002/dvdy.24231
Leukemia
巻: 29 ページ: 753-7
10.1038/leu.2014.316
Bone Miner. Res.
巻: 30 ページ: 706-14
10.1002/jbmr.2379
Curr Top Microbiol Immunol.
巻: 381 ページ: 21-49
10.1007/82_2014_374
Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
巻: 111 ページ: 12151-6
10.1073/pnas.1407370111
Cell Reports
巻: 8 ページ: 767-82
10.1016/j.celrep
Nat. Immunol.
巻: 15 ページ: 439-48
10.1038/ni.2864
