ネオグライコバイオロジクスの創製とリソソーム病治療薬開発への応用

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 26293120
• 研究機関: 徳島大学
• 研究代表者: 伊藤 孝司 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 教授 (00184656)
• 研究分担者: 辻 大輔 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 助教 (00423400) ; 広川 貴次 独立行政法人産業技術総合研究所, 創薬分子プロファイリング研究センター, 研究員 (20357867)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: ネオグライコバイオジクス / リソソーム病 / エンドグリコシダーゼM / N型糖鎖オキサゾリン誘導体 / タンパク-タンパク相互作用 / 酵素補充療法 / 疾患iPS細胞

研究実績の概要

組換え糖タンパク質を用いるバイオ医薬品の問題点である、糖鎖の不均一性に基づく有効性低下と副作用を改善すべく、本研究では、遺伝性リソソーム酵素欠損症（リソソーム病）を対象に、標的細胞内取り込みに必要、かつ均一な機能性合成糖鎖付加型の組換えヒトリソソーム酵素（ネオグライコ酵素）の作製技術開発と疾患モデルを用いる有効性評価を進めている。
平成26年度は、
1.組換えカイコ絹糸腺から精製したヒト活性型カテプシンA（CTSA）をエンドグリコシダーゼH（endoH）で処理して得られる、GlcNAc１残基を含む糖タンパクアクセプターとして、また均一N型糖鎖ドナーとして、高マンノース型糖鎖、末端シアル含有２分岐型および末端α-ガラクトース含有２分岐型糖鎖のオキサゾリン誘導体を用い、改変型エンドグリコシダーゼM（endoM N175Q）のトランスグリコシレーション作用により、CTSAに上記の均一N型糖鎖を20％以上の効率で付加することに成功した。
2.研究分担者の広川（産総研）が、GM2ガングリオシド分解能をもつ改変型β-ヘキソサミニダーゼB（HexB）との結合親和性増大を予測してアミノ酸置換型GM2活性化タンパク（GM2A）をin silicoデザインした。代表者の伊藤が、同GM2A、正常ヒトGM2AとN型糖鎖追加型GM2Aの発現ベクターを作製してメタノール資化酵母に導入し、各GM2Aの恒常発現株を樹立し、培養上清からの精製を試みている。また研究協力者の大髙（徳島大薬）らは、複数のアミノ酸置換型GM2Aの化学合成に成功した。
3.研究分担者の辻（徳島大薬）が樹立した、HexA及びCTSA欠損症患者由来iPS細胞株から、京都大iPS細胞研の井上治久教授らの方法に従い、大脳皮質神経細胞を分化誘導する方法を開発した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

1.　N型糖タンパクアクセプターとして組換えカイコ絹糸腺からヒトカテプシンA（CTSA）を大量精製でき、また高マンノース型糖鎖などの均一N型糖鎖オキサゾリン誘導体の作製と改変型エンドグリコシダーゼMのトランスグリコシレーション作用により、CTSAに均一N型糖鎖を20％以上の効率で付加することに成功したこと。
2.　in silicoデザインとアミノ酸置換導入に基づく、改変型GM2活性化タンパク（GM2A）を恒常発現するメタノール資化酵母株の樹立と、複数のアミノ酸置換型GM2Aの化学合成に成功したこと。
3.　HexA及びCTSA欠損症患者由来iPS細胞株から大脳皮質神経細胞を分化誘導する培養条件を確立できたことなどから、H26年度の目的は概ね達成できたため。

今後の研究の推進方策

今後も当初の計画に従い、研究を推進するが、
1.　N型糖タンパクアクセプターとしてのヒトリソソーム酵素を大量精製でき、また均一なN型糖鎖オキサゾリン誘導体の合成や調製法は確立できたので、今後は均一N型糖鎖のアクセプターへの付加効率を60%以上まで向上させることを目的とする。
2.　in silicoデザインとアミノ酸置換導入に基づく、改変型GM2活性化タンパク（GM2A）を、恒常発現メタノール資化酵母株の培養上清から精製とともに、化学合成改変型GM2Aの改変型HexBやGM2との結合、またin vitroでの機能を検証する。
3.　HexA及びCTSA欠損症患者由来iPS細胞株から分化誘導した大脳皮質神経細胞の培養系に投与し、改変型HexBやGM2Aの細胞内取り込みや有効性を検討する予定である。

次年度使用額が生じた理由

356,400円の余剰分はBack crossﾏｳｽの凍結胚作製が遅延したため次年度へ。H27. 4.24に支払済み。

次年度使用額の使用計画

Back crossマウスの凍結胚をH27. 3.18に、徳島大学大学院医歯薬学研究部・総合研究支援センター・動物資源部門にて個体に戻し、同動物実験施設にて飼育・実験を行う。

研究成果

• [雑誌論文] In vivo crystallography at X-ray free-electron lasers: the next generation of structural biology? (2014)
  • 著者名/発表者名: Gallat, F.-X., Matsugaki, N., Coussens, N.P., Yagi, J.K., Boudes, M., Higashi, T., Tsuji, D., Tatano, Y., Suzuki, M., Mizohata, E., Tono, K., Hatui, Y., Yabashi, M., Nango, E., Itoh, K., Coulibaly, F., Tobe, S., Ramaswamy, S., Iwata, S. and Chavas, M. L.
  • 雑誌名: The Royal Society 巻: 369 ページ: 20130497
  • DOI: 10.1098/rstb.2013.0497
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Pim-2 kinase is an important target of treatment for tumor progression and bone loss in myeloma (2014)
  • 著者名/発表者名: Hiasa, M., Teramachi, J., Oda, A., Amachi, R., Harada, T., Nakamura, S., Miki, H., Fujii, S., Kagawa, K., Watanabe, K., Endo, I., Kuroda, Y., Yoneda, T., Tsuji, D., Nakao, M., Tanaka, E., Hamada, K., Sano, S., Itoh, K., Matsumoto, T. and Masahiro Abe, M.
  • 雑誌名: Leukemia 巻: 29 ページ: 207-217
  • DOI: 10.1038/leu.2014.147
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 組換えカイコを用いるネオグライコバイオロジクスの創製 (2015)
  • 著者名/発表者名: 伊藤 孝司
  • 学会等名: 日本薬学会第135年会
  • 発表場所: 神戸学院大学（兵庫県神戸市）
  • 年月日: 2015-03-26
  • 招待講演
• [学会発表] Gaucher disease caused by possible atypical mechanism. (2015)
  • 著者名/発表者名: K. Miyoshi, T. Horiguchi, A. Tanimura, H. Hiroko, Y. Touda, S. Kagami, K. Mori, D. Tsuji, K. Itoh and T. Noma
  • 学会等名: Gordon Research Conference
  • 発表場所: Hotel Galvez（USA,Galveston）
  • 年月日: 2015-03-17
• [学会発表] 改変型β-ヘキソサミニダーゼの有効性を評価 (2015)
  • 著者名/発表者名: 北風 圭介,田崎 智佳子,水谷 安通,杉山 栄二,神谷 真子,瀬藤 光利,浦野 泰照,櫻庭 均,伊藤 孝司
  • 学会等名: 臨床遺伝学公開シンポジウム2015「リソソーム病 現在と未来」
  • 発表場所: 明治薬科大学（東京都清瀬市）
  • 年月日: 2015-03-12
  • 招待講演
• [学会発表] Development of protease-resisitant modified human beta-hexosaminidase B and evaluation of intracerebroventricular replacement effects on GM2 gangliosidosis model mice. (2015)
  • 著者名/発表者名: K. Kitakaze, C. Tasaki, Y. Mizutani, E. Sugiyama, M. Ikuo, M. Kamiya, M. Setou, Y. Urano Yasuteru and Kouji Itoh
  • 学会等名: The 11th Annual World Symposium 2015
  • 発表場所: Hyatt Regency Orlando（USA, Orlando)
  • 年月日: 2015-02-10
• [学会発表] 糖タンパク医薬品の創製に向けた糖鎖改変技術 (2014)
  • 著者名/発表者名: 伊藤 孝司
  • 学会等名: 第12回糖鎖科学コンソーシアムシンポジウム
  • 発表場所: 東京医科歯科大学（東京都文京区）
  • 年月日: 2014-12-04
  • 招待講演
• [学会発表] 患者由来iPS 細胞の樹立と中枢神経系モデルの構築 (2014)
  • 著者名/発表者名: 今滝 泉, 辻 大輔, 櫻庭 均, 伊藤 孝司
  • 学会等名: 第53回日本薬学会・日本薬剤師会・日本病院薬剤師会 中国四国支部学術大会
  • 発表場所: 広島国際会議場(広島県広島市)
  • 年月日: 2014-11-09
• [学会発表] メタノール資化性酵母株発現系による組換えマンノース6- リン酸受容体の生産・精製と機能検討 (2014)
  • 著者名/発表者名: 河野 加菜子, 北風 圭介, 辻 大輔, 千葉 靖典, 伊藤 孝司
  • 学会等名: 第53回日本薬学会・日本薬剤師会・日本病院薬剤師会 中国四国支部学術大会
  • 発表場所: 広島国際会議場(広島県広島市)
  • 年月日: 2014-11-09
• [学会発表] 新規タンパク質チオエステル調製法の開発 (2014)
  • 著者名/発表者名: 津田 雄介, 重永 章, 傳田 将也, 佐藤 浩平, 北風 圭介, 中村 太寛, 猪熊 翼, 伊藤 孝司, 大髙 章
  • 学会等名: 第53回日本薬学会・日本薬剤師会・日本病院薬剤師会中国四国支部学術大会
  • 発表場所: 広島国際会議場(広島県広島市)
  • 年月日: 2014-11-08
• [学会発表] 改変U1snRNAによるヒトカテプシンAスプライス異常修復の試み (2014)
  • 著者名/発表者名: 田中 翔子, 金澤 慶祐, 山﨑 尚志, 池 啓伸, 伊藤 孝司, 南川 典昭, 滝口 祥令
  • 学会等名: 第53回 日本薬学会・日本薬剤師会・日本病院薬剤師会 中国四国支部学術大会
  • 発表場所: 広島国際会議場(広島県広島市)
  • 年月日: 2014-11-08
• [学会発表] 改変型ヒトβ- Hexosaminidase のGM2 蓄積症モデルに対する治療効果の評価 (2014)
  • 著者名/発表者名: 北風 圭介, 田崎 智佳子, 水谷 安通, 杉山 栄二, 神谷 真子, 瀬藤 光利, 浦野 泰照, 伊藤 孝司
  • 学会等名: 第5回グライコバイオロジクス研究会
  • 発表場所: 臨床研究情報センター(兵庫県神戸市)
  • 年月日: 2014-11-01
• [学会発表] 組換えカイコ由来ヒトリソソーム酵素の分子特性とグライコシンターゼによる in vitro 糖鎖修飾 (2014)
  • 著者名/発表者名: 西岡 宗一郎, 小林 功, 辻 大輔, 原囿 景, 久保 勇樹, 真板 宣夫, 池戸 駿介, 東 哲也, 辻 大輔, 瀬筒 秀樹, 町井 博明, 石井 明子, 川崎 ナナ, 伊藤 孝司
  • 学会等名: 第5回グライコバイオロジクス研究会
  • 発表場所: 臨床研究情報センター(兵庫県神戸市)
  • 年月日: 2014-11-01
• [学会発表] Preparation of Peptide/protein Thioesters Using a Chemical Protocol Applicable to Expressed Proteins. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yusuke Tsuda, Akira Shigenaga, Masaya Denda, Kohei Sato, Keisuke Kitakaze, Takahiro Nakamura, Tsubasa Inokuma, Kouji Itou and Akira Otaka
  • 学会等名: 51th The Japanese Peptide Society
  • 発表場所: 徳島大学（徳島県徳島市）
  • 年月日: 2014-10-23
• [学会発表] Development of N-glycosylated asparagine ligation and its application to total chemical synthesis of GM2 activator protein. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kohei Sato, Keisuke Kitakaze, Ken Sakamoto, Akira Shigenaga, Tsubasa Inokuma, Daisuke Tsuji, Kouji Itou and Akira Otaka
  • 学会等名: 51th The Japanese Peptide Society
  • 発表場所: 徳島大学（徳島県徳島市）
  • 年月日: 2014-10-23
• [学会発表] 改変型ヒトβ-ヘキソサミニダーゼの分子特性解析とGM2蓄積症モデル細胞への補充効果 (2014)
  • 著者名/発表者名: 水谷 安通, 北風 圭介, 田崎 智佳子, 伊藤 孝司, 櫻庭 均, 伊藤 孝司
  • 学会等名: 第87回日本生化学会大会
  • 発表場所: 国立京都国際会館（京都府京都市）
  • 年月日: 2014-10-18
• [学会発表] トランスジェニックカイコ由来ヒトリソソーム酵素の分子特性解析とグライコシンターゼによる糖鎖修飾 (2014)
  • 著者名/発表者名: 西岡 宗一郎, 小林 功, 辻 大輔, 原囿 景, 久保 勇樹, 真板 宣夫, 池戸 駿介, 東 哲也, 辻 大輔, 瀬筒 秀樹, 町井 博明, 石井 明子, 川崎 ナナ, 伊藤 孝司
  • 学会等名: 第87回日本生化学会大会
  • 発表場所: 国立京都国際会館（京都府京都市）
  • 年月日: 2014-10-18
• [学会発表] GM2蓄積症モデルマウスに対する改変型ヒトβーヘキソサミニダーゼの有効性評価 (2014)
  • 著者名/発表者名: 北風 圭介, 田崎 智佳子, 水谷 安通, 杉山 栄二, 神谷 真子, 瀬藤 光利, 浦野 泰照, 伊藤 孝司
  • 学会等名: 第87回日本生化学会大会
  • 発表場所: 国立京都国際会館（京都府京都市）
  • 年月日: 2014-10-18
• [学会発表] メタノール資化性酵母株発現系によるマンノース6-リン酸受容体の生産・精製と機能検討 (2014)
  • 著者名/発表者名: 河野 加菜子, 辻 大輔, 千葉 靖典, 伊藤 孝司
  • 学会等名: 第87回日本生化学会大会
  • 発表場所: 国立京都国際会館（京都府京都市）
  • 年月日: 2014-10-18
• [学会発表] 改変型ヒトβ-HexosaminidaseのGM2蓄積症モデルに対する有効性評価 (2014)
  • 著者名/発表者名: 北風 圭介, 田崎 智佳子, 水谷 安通, 杉山 栄二, 神谷 真子, 瀬藤 光利, 浦野 泰照, 伊藤 孝司
  • 学会等名: 第13回若手ファーマ・バイオフォーラム2014
  • 発表場所: 富山国際会議場（富山県富山市）
  • 年月日: 2014-09-20
• [学会発表] Synthetic study of GM2 activator protein using N-sulfanylethylanilide peptide. (2014)
  • 著者名/発表者名: K. Sato, K. Kitakaze, K. Sakamoto, A. Shigenaga, D. Tsuji, K. Itoh and A. Otaka
  • 学会等名: The 33rd European Peptide Symposium
  • 発表場所: National Palace of Culture Sofia(Bulgaria,Sofia)
  • 年月日: 2014-08-31
• [学会発表] GM2蓄積症モデルに対する改変型ヒトβーヘキソサミニダーゼの有効性と機能評価 (2014)
  • 著者名/発表者名: 北風 圭介, 田崎 智佳子, 水谷 安通, 杉山 栄二, 神谷 真子, 瀬藤 光利, 浦野 泰照, 伊藤 孝司
  • 学会等名: 第33回日本糖質学会年会
  • 発表場所: 名古屋大学豊田講堂（愛知県名古屋市）
  • 年月日: 2014-08-10
• [学会発表] 組み換えカイコ絹糸腺由来ヒトカテプシンAの分子特性とエンドグリコシダーゼによる糖鎖改変 (2014)
  • 著者名/発表者名: 西岡 宗一郎, 小林 功, 辻 大輔, 原囿 景, 久保 勇樹, 真板 宣夫, 池戸 駿介, 東 哲也, 辻 大輔, 瀬筒 秀樹, 町井 博明, 石井 明子, 川崎 ナナ, 伊藤 孝司
  • 学会等名: 第33回日本糖質学会年会
  • 発表場所: 名古屋大学豊田講堂（愛知県名古屋市）
  • 年月日: 2014-08-10
• [学会発表] 天然アミノ酸配列に適用可能な新規タンパク質チオエステル合成法の開発 (2014)
  • 著者名/発表者名: 津田 雄介, 重永 章, 佐藤 浩平, 中村 太寛, 北風 圭介, 猪熊 翼, 伊藤 孝司, 大髙 章
  • 学会等名: 日本ケミカルバイオロジー学会第9回年会
  • 発表場所: 大阪大学（大阪府吹田市）
  • 年月日: 2014-08-10
• [学会発表] トランスジェニックカイコ由来ヒトリソソーム酵素の分子特性解析と化学酵素法に基づく人工糖鎖修飾 (2014)
  • 著者名/発表者名: 西岡 宗一郎, 小林 功, 辻 大輔, 原囿 景, 久保 勇樹, 真板 宣夫, 池戸 駿介, 東 哲也, 辻 大輔, 瀬筒 秀樹, 町井 博明, 石井 明子, 川崎 ナナ, 伊藤 孝司
  • 学会等名: 第55回日本生化学会 中国・四国支部例会
  • 発表場所: 愛媛大学城北キャンパス(愛媛県松山市）
  • 年月日: 2014-06-06
• [学会発表] GM2蓄積症の新規治療薬開発を目指した機能改変型ヒトβーヘキソサミニダーゼの作製と評価 (2014)
  • 著者名/発表者名: 北風 圭介, 田崎 智佳子, 水谷 安通, 神谷 真子, 浦野 泰照, 伊藤 孝司
  • 学会等名: 第55回日本生化学会 中国・四国支部例会
  • 発表場所: 愛媛大学城北キャンパス(愛媛県松山市）
  • 年月日: 2014-06-06
• [学会発表] リソソーム病に対するiPS創薬を目指して ―神経難病患者由来iPS細胞の病態解明・治療法開発への応用― (2014)
  • 著者名/発表者名: 伊藤 孝司
  • 学会等名: 京都大学iPS細胞研究所 井上治久研究室セミナー
  • 発表場所: 京都大学（京都府京都市）
  • 年月日: 2014-05-08
• [図書] シアリドーシス 東京別冊日本臨牀 新領域別症候群(第2版)Ⅳ (2014)
  • 著者名/発表者名: 伊藤 孝司
  • 総ページ数: 5（320-324）
  • 出版者: 日本臨牀社
• [図書] ガラクトシアリドーシス 別冊日本臨牀 新領域別症候群(第2版)Ⅳ (2014)
  • 著者名/発表者名: 伊藤 孝司
  • 総ページ数: 5（320-324）
  • 出版者: 日本臨牀社
• [図書] ガラクトシアリドーシス 日本臨牀社 別冊日本臨牀 新領域別症候群(第2版)Ⅲ (2014)
  • 著者名/発表者名: 伊藤 孝司
  • 総ページ数: 4（796-799）
  • 出版者: 日本臨牀社
• [備考] 徳島大学大学院薬科学教育部附属医薬創製教育研究センター・創薬生命工学分野ホームページ
  • URL: http://www.tokushima-u.ac.jp/ph/faculty/labo/btc/