| 研究課題/領域番号 |
26293176
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| 研究機関 | 徳島大学 |
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研究代表者 |
高山 哲治 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部, 教授 (10284994)
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| 研究分担者 |
佐野 茂樹 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部, 教授 (20226038)
中川 忠彦 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部, 特任助教 (40634275)
六車 直樹 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部, 准教授 (90325283)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | ACF / 分子イメージング / 蛍光プローブ |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、大腸の微小前癌病変と考えられるaberrant crypt foci (ACF)に特異的に発現する分子を標的とする蛍光標識プローブを作成し、in vitroおよびin vivoでACFの高感度分子イメージング法を開発しようとするものである。平成26年度は、ACFのマイクロアレイ解析およびTaqman PCRにより、glut-1, platelet derived growth factor receptor (PDGF), epidermal groeth factor receptor (EGFR), glutathione S-transferase (GST)-πなどの分子が過剰発現していることを見出した。今年度は、glut-1に対する標識プローブとして2-TRG [Texas Red (sulforhodamine101 acid)- coupled 2-amino-2deoxyglucose]、PDGFRに対する標識プローブとしてTexas Red標識dasatinibを合成した。また、EGFRに対しては抗EGFR抗体をAlexa Fluorで標識したプローブを合成した。GST-πに対しては、GSTにより活性化される標識プローブを実験に用いた。これらの蛍光標識プローブを用いて、in vitroで大腸癌細胞株であるDLD1, CCK81, M7609細胞を用いて蛍光強度を調べるとともにEadie- Hofstee plot 解析を行い、反応速度及び反応動態を明らかにした。また、ラットにazoxymethaneを投与し、ACFの形成される８週後に屠殺して摘出した大腸にこれらの標識プローブを散布し、ACFが蛍光顕微鏡下に観察しうることを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度は、ヒトACFに高発現するglut-1, PDGFR, EGFR, GST-πを標的とする蛍光標識プローブを作成することができた。これらのプローブをヒト大腸癌細胞株とin vitroで反応させることによりこれらのプローブの特性、反応性を解析することができた。さらに、動物のACFにおいてこれらの分子が発現していることを確認するとともに、動物の大腸粘膜に散布して蛍光観察を行うことにより、蛍光を強く発するACFを観察することができた。とくに、glut-1やGST-πに対する蛍光標識プローブでACFを比較的良く観察することができた。このように、蛍光プローブを作成し、動物でACFをイメージングできたという点で概ね順調に進展していると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度作成したglut-1に対する2-TRG [Texas Red (sulforhodamine101 acid)- coupled 2-amino-2deoxyglucose]、PDGFRに対する標識プローブとしてTexas Red標識dasatinib、Alexa Fluorで標識した抗EGFRモノクローナル抗体、GSTにより活性化される蛍光標識プローブを用いて、動物およびヒト大腸組織を用いて以下の分子イメージングを行う。
1) azoxymethane投与ラット大腸発癌モデルを作成し、ACFが形成される8週目にラットを屠殺し、上記の各種蛍光標識プローブを散布して蛍光顕微鏡下にACFを経時的に観察する。また、蛍光標識プローブを静脈内投与してACFの分子イメージングを試み、局所散布したときと画像、感度、特異性などを比較検討する。
2) 大腸癌細胞株DLD1細胞をヌードマウスのS状結腸に同所移植を行う。IVISにより腫瘍を観察し、大きさが3mmになったところで上記の蛍光標識プローブを経静脈内投与し、動物用内視鏡を用いて蛍光観察を行う。
3)書面による同意を得たのちに、ヒト大腸癌の切除予定症例に大腸内視鏡検査を行う際、通常のメチレンブルー染色により癌の近傍(肛門側または口側7cm)のACF数を評価する。手術後に切除標本を用いて、同じ領域に上記各種プローブを散布して蛍光顕微鏡下に観察し、ACFのイメージングを行う。
4)最後に、マウスを用いて上記蛍光標識プローブの毒性試験を行い、臨床応用の基盤とする。
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