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2014 年度 実績報告書

酸化ストレス応答シグナルの網羅的解析による肝発癌機構の解析

研究課題

研究課題/領域番号 26293179
研究機関川崎医科大学

研究代表者

日野 啓輔  川崎医科大学, 医学部, 教授 (80228741)

研究分担者 原 裕一  川崎医科大学, 医学部, 講師 (60550952)
仁科 惣治  川崎医科大学, 医学部, 講師 (70550961)
岸 文雄  川崎医科大学, 医学部, 教授 (40153077)
池田 正徳  鹿児島大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (30315767)
研究期間 (年度) 2014-04-01 – 2017-03-31
キーワードミトコンドリア / マイトファジー / リン酸化シグナル / 活性酸素種 / C型肝炎ウイルス
研究実績の概要

HCVはミトコンドリアの品質管理であるマイトファジーを抑制することで、酸化ストレスを増幅かつ持続させることを明らかにしてきた(Am J Pathol 2014)。活性酸素種(ROS)に起因する酸化ストレスの分子機構は、不対電子をもつフリーラジカルによる細胞内高分子の傷害とH2O2に代表され表される非ラジカルoxidantによる細胞内シグナルの障害やレドックス制御機構の破綻に大別される。しかし、非ラジカルoxidantによる細胞内シグナルの障害やレドックス制御機構の破綻がどのように肝発癌と関連しているかは殆ど明らかにされていない。そこで今年度はHCV-JFH1株感染細胞ならびにヒト肝細胞キメラマウスを用いて、Type 2(脱分極誘導型)マイトファジー抑制下での細胞内蛋白質のリン酸化状態を、液体クロマトグラフ質量分析計(LC/MS)を利用したiTRAQリン酸化部位同定・相対的定量解析を行った。ROS産生が亢進しているHCV感染細胞では488種類の蛋白に質量変化を認め、そのうち80.3%がリン酸化による質量増加であった。リン酸化を受けたアミノ酸の97%がserine、3%がthreonineであり、ストレス応答性kinaseであるserine/threonine kinaseの活性亢進が示唆された。一方、キメラマウスの肝組織ではROS産生の亢進を伴わず86種類の蛋白に質量変化を認め、リン酸化による変化が46.5%、脱リン酸化による変化が53.5%であった。以上の結果から、HCVによるマイトファジーの抑制は酸化ストレスを亢進させ、ROSの産生亢進がストレス応答性kinaseを活性化させ、細胞内のリン酸化シグナルを亢進させるのではないかと推測された。しかし、in vitroとin vivoでの細胞内のリン酸化シグナル活性化には差が認められ、更なる検討が必要と考えられる。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

HCV感染細胞における酸化ストレス状態での細胞内リン酸化蛋白の網羅的解析までは行ったが、リン酸化が亢進した蛋白質の同定ならびにその蛋白が介在するシグナルの解析が遅れている。細胞内リン酸化蛋白の網羅的解析が平成26年度の終盤に終了したことが一番の原因と考えられる。

今後の研究の推進方策

ROS産生亢進に伴う細胞内リン酸化シグナルの代表的経路について、リン酸化が亢進した蛋白質の同定を行う。HCVによる直接的リン酸化シグナルの亢進ではないことを明らかにするために、HCV感染細胞に抗酸化剤を添加した状態で同様に細胞内タンパク質のリン酸化が亢進しているか否かを検討する。また、酸化ストレス応答性リン酸化シグナルの活性変化がkinase活性亢進に基づくものか否かを明らかにするために、変化の確認されたシグナルに対応するkinase阻害剤を用いて、シグナル活性の可逆性を確認する。
多くの抗酸化酵素や抗酸化タンパク質の発現誘導は、これらの遺伝子上流に存在するantioxidant response element (ARE)に転写因子であるNrf2が結合して行われる。非ストレス下ではKeap1(E3 ubiquitin ligaseのアダプターとして作用)はNrf2をプロテアソーム系による分解に導くが、Keap1の酸化ストレスセンサーはCys273とCys288であることが報告されている(Mol Cell Biol 2008)。HCV誘導の酸化ストレス下においてHCVタンパクがNrf2-Keap1経路による抗酸化機能に与える影響はこれまで検討されていない。そこで、HCV感染細胞を用いて、Nrf2の核への局在の有無を検討する。さらにNrf2のDNA結合能についてはElecrophoreic mobility shift assay法で検討する。

次年度使用額が生じた理由

当初予定していた平成26年度の実験遂行がやや遅れたため、物品費の支出が予定額より少なくなり、このため次年度の実験(研究)に経費を持ち越すこととなった。

次年度使用額の使用計画

持ち越しとなった助成金は、平成26年度の計画のなかで行えなかった実験(とくにリン酸化が亢進した細胞内シグナルとリン酸化蛋白の同定)費用に充てる予定であり、平成27年度研究費は当初の研究計画に準じて平成27年度研究経過の実験に使用する予定である。

  • 研究成果

    (11件)

すべて 2015 2014

すべて 雑誌論文 (5件) (うち国際共著 2件、 査読あり 5件、 謝辞記載あり 4件) 学会発表 (3件) 図書 (3件)

  • [雑誌論文] Branched-chain amino acids reduce hepatic iron accumulation and oxidative stress in hepatitis C virus polyprotein-expressing mice2015

    • 著者名/発表者名
      Korenaga M, Nishina S, Korenaga K, Tomiyama Y, Yoshioka N, Hara Y, Sasaki Y, Shimonaka Y, Hino K
    • 雑誌名

      Liver International

      巻: 35 ページ: 1303-14

    • DOI

      10.1111/liv.12675

    • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Association between Wisteria floribunda agglutinin-positive Mac-2 binding protein and the fibrosis stage of non-alcoholic fatty liver disease2015

    • 著者名/発表者名
      Abe M, Miyake T, Hino K, Mizokami M, Narimatsu H, et al.
    • 雑誌名

      Journal of Gastroenterology

      巻: 50 ページ: 776-84

    • DOI

      10.1007/s00535-014-1007-2

    • 査読あり / 国際共著
  • [雑誌論文] Hepatic oxidative stress in ovariectomized transgenic mice expressing the hepatitis C virus polyprotein is augmented through suppression of adenosine monophosphate-activated protein kinase/proliferator-activated receptor gamma co-activator 1 alpha signaling2014

    • 著者名/発表者名
      Tomiyama Y, Nishina S, Hara Y, kawase T, Hino K
    • 雑誌名

      Hepatology research : the official journal of the Japan Society of Hepatology

      巻: 44 ページ: E229-39

    • DOI

      10.1111/hepr.12254

    • 査読あり / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Mitochondrial reactive oxygen species as a mystery voice in hepatitis C2014

    • 著者名/発表者名
      HinoK, Hara Y, Nishina S
    • 雑誌名

      Hepatology research : the official journal of the Japan Society of Hepatology

      巻: 44 ページ: 123-32

    • DOI

      10.1111/hepr.12247

    • 査読あり / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Hepatitis C virus core protein suppresses mitophagy by interacting with parkin in the context of mitochondrial depolarization2014

    • 著者名/発表者名
      Hara Y, Yanatori I, Ikeda M, Kiyokage E, Nishina S, Tomiyama Y, Toida K, Kishi F, Kato N, Imamura M, Chayama K, Hino K
    • 雑誌名

      The American journal of pathology

      巻: 184 ページ: 3026-39

    • DOI

      10.1016/j.ajpath.2014.07.024

    • 査読あり / 謝辞記載あり
  • [学会発表] Oral glucose tolerance test predicts hepatic fibrosis in nonalcoholic fatty liver disease patients without overt diabetes mellitus.2014

    • 著者名/発表者名
      Nishina S, Hyogo H, Kawanaka M, Miyake T, Abe M, Yamashita S, Tobita H, Sato S, Hiasa Y, Chayama K, Hino K
    • 学会等名
      The 65th Annual Meeting of the American Association for the Study of Liver Diseases
    • 発表場所
      Hynes Convention Center, Boston, USA
    • 年月日
      2014-11-09 – 2014-11-09
  • [学会発表] Hepatitis C virus core protein suppresses mitophagy by interacting with Parkin in the context of mitochondrial depolarization2014

    • 著者名/発表者名
      Hara Y, Yanatori I, Ikeda M, Kiyokage E, Nishina S, Tomiyama Y, Toida K, Kishi F, Kato N, Imamura M, Chayama K, Hino K
    • 学会等名
      5th World Congress on Targeting Mitochondria
    • 発表場所
      Ritz Carlton Hotel, Berlin, Germany
    • 年月日
      2014-10-30 – 2014-10-30
  • [学会発表] HCVとミトコンドリアのバイオジェネーシスとの関連性2014

    • 著者名/発表者名
      原 裕一, 仁科 惣治, 日野 啓輔
    • 学会等名
      第50回日本肝臓学会総会
    • 発表場所
      ホテルニューオータニ、東京
    • 年月日
      2014-05-30 – 2014-05-30
  • [図書] HEPATOLOGY PRACTICE(第3巻)2014

    • 著者名/発表者名
      原裕一, 日野啓輔
    • 総ページ数
      321
    • 出版者
      文光堂
  • [図書] 酸化ストレスの医学2014

    • 著者名/発表者名
      原裕一, 日野啓輔
    • 総ページ数
      444
    • 出版者
      診断と治療社
  • [図書] HEPATOLOGY PRACTICE(第4巻)2014

    • 著者名/発表者名
      仁科惣治, 日野啓輔
    • 総ページ数
      340
    • 出版者
      文光堂

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公開日: 2016-06-01  

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