「脱細胞化マトリックスを用いた心臓の再生」～立体臓器構築をめざした基盤技術の確立

2015 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 26293188
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 李 鍾國 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 寄附講座准教授 (60303608)
• 研究分担者: 宮川 繁 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任准教授(常勤) (70544237)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 再生医学 / 組織工学 / 脱細胞化マトリックス / 臓器構築 / 3次元心筋組織

研究実績の概要

本研究課題においては、これまでに3次元心筋組織の構築を目的として、成獣ラット心臓を界面活性剤を用いて脱細胞処理を行い、新生仔ラット培養心臓構成細胞を冠動脈から再播種し、再細胞化を行った。その結果、再播種数日後より再細胞化心臓は収縮を示し、典型的なサンプルでは立体組織全体に安定した興奮伝播を示したが、一部の心臓では興奮は不安定であった(Yasui et al. Biomaterials. 2014)。この興奮伝播の不均一性は、再播種心筋の不十分かつ不均一な生着が原因と考え、ラット心臓構成細胞、特に心筋細胞においてintegrin-beta1、laminin-a2、VE-cadhelin等の接着因子発現を促進するパラクライン因子の探索を行った。その結果、EGF, bFGF, vEGF, IGF1, Ascorbic acid, Heparin, Hydrocortisone を含む培養液中で培養を行うと、培養3日目における心筋細胞のlaminin-a2とVE-cadhelinの遺伝子発現が有意に増強した。一方、integrinの発現は有意な差が見られなかった。
一方、ラットおよびヒトiPS細胞から心筋細胞への分化誘導を行い、ほぼすべてのサンプルで自己拍動細胞塊を得ている。ライブセルイメージング法による観察により、心筋細胞様の活動電位およびCaトランジエントが見られており、iPS細胞由来心筋細胞を用いた3次元心筋組織構築に向けた研究を現在進めている。
新生仔ラット心臓に対して界面活性剤を用いた脱細胞化を行ったところ、成獣心臓同様にほぼすべての細胞成分が除去され、3次元心筋組織構築のscaffoldとなりうることが示唆され、再細胞化心臓の構築に向けた研究を進めている。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

成獣心由来マトリックスをすべて再細胞化するに十分に足る数のiPS細胞由来心筋細胞を得ることにおいて技術的な困難が生じている。

今後の研究の推進方策

iPS細胞由来心筋細胞を用いた3次元心臓組織の構築と心臓構成細胞が細胞外マトリックスへの生着・生存に及ぼす関連因子の探索を行う。前者については、今後得ることが可能なiPS細胞由来心筋細胞数に対応するために、細胞外マトリックスを成獣ラット心筋ではなく、より幼若な心臓を用い、播種心筋細胞の数を減らし、研究を遂行する。後者については、血管内皮関連因子、炎症性サイトカイン、ストレス関連因子、心筋発生・成長因子の影響をQ-PCRやハイコンテンツイメージングシステム・ハイスループットスクリーニングシステム等を用い探索する。

研究成果

• [雑誌論文] A New In Vitro Co-Culture Model Using Magnetic Force-Based Nanotechnology. (2016)
  • 著者名/発表者名: Takanari H, Miwa K, Fu X, Nakai J, Ito A, Ino K, Honda H, Tonomura W, Konishi S, Opthof T, van der Heyden MA, Kodama I, Lee JK
  • 雑誌名: J Cell Physiol 巻: 9999 ページ: 1-8
  • DOI: 10.1002/jcp.25342
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Generation of Induced Pluripotent Stem Cells From Patients With Duchenne Muscular Dystrophy and Their Induction to Cardiomyocytes (2016)
  • 著者名/発表者名: Hashimoto A, Naito AT, Lee JK, Kitazume-Taneike R, Ito M, Yamaguchi T, Nakata R, Sumida T, Okada K, Nakagawa A, Higo T, Kuramoto Y, Sakai T, Tominaga K, Okinaga T, Kogaki S, Ozono K, Miyagawa S, Sawa Y, Sakata Y, Morita H, Umezawa A, Komuro I
  • 雑誌名: Int Heart J 巻: 57 ページ: 112-117
  • DOI: 10.1536/ihj.15-376
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Centrifugal microfluidic platform for single-cell level cardiomyocyte-based drug profiling and screening (2015)
  • 著者名/発表者名: Espulgar W, Aoki W, Ikeuchi T, Mita D, Saito M, Lee JK, Tamiya E
  • 雑誌名: Lab Chip 巻: 15 ページ: 3572-3580
  • DOI: 10.1039/c5lc00652j
  • 査読あり
• [雑誌論文] Optical microscopy imaging for the diagnosis of the pharmacological reaction of mouse embryonic stem cell-derived cardiomyocytes (mESC-CMs) (2015)
  • 著者名/発表者名: Ikeuchi T, Espulgar W, Shimizu E, Saito M, Lee JK, Dou X, Yamaguchi Y, Tamiya E.
  • 雑誌名: Analyst 巻: 140 ページ: 6500-6507
  • DOI: 10.1039/c5an01144b
  • 査読あり
• [雑誌論文] Pirfenidone exhibits cardioprotective effects by regulating myocardial fibrosis and vascular permeability in pressure-overloaded hearts (2015)
  • 著者名/発表者名: Yamagami K, Oka T, Wang Q, Ishizu T, Lee JK, Miwa K, Akazawa H, Naito AT, Sakata Y, Komuro I
  • 雑誌名: Am J Physiol Heart Circ Physiol 巻: 309 ページ: H512-522
  • DOI: 10.1152/ajpheart.00137.2015
  • 査読あり
• [学会発表] Autonomic innervation to engineered cardiac tissues- Implication to Biological Pacemaker (2015)
  • 著者名/発表者名: 李 鍾國
  • 学会等名: 第79回日本循環器学会学術集会
  • 発表場所: 大阪市
  • 年月日: 2015-04-24 – 2015-04-24
  • 招待講演