ヒストンH3K27メチル化脱制御による骨髄異形成症候群発症機構の解析

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 26293227
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 本田 浩章 広島大学, 原爆放射線医科学研究所, 教授 (40245064)
• 研究分担者: 稲葉 俊哉 広島大学, 原爆放射線医科学研究所, 教授 (60281292) ; 上田 健 広島大学, 原爆放射線医科学研究所, 助教 (60585149) ; 本田 善一郎 お茶の水女子大学, 保健管理センター, 教授 (70238814)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 骨髄異形成症候群 / PRC2 / ヒストンH3K27メチル化 / EED / コンディショナルノックアウトマウス

研究実績の概要

今年度は、我々はEED cKOヘテロマウスを用いて、EEDヘテロ状態と造血器腫瘍発症の関連について検討を行った。
まず、EED cKOヘテロマウスを長期飼育し、造血器腫瘍発症の有無について観察を行ったが、血液の異常を呈するマウスは認められなかった。そこで、EEDのヘテロ状態に加えて2次的遺伝子異常が造血器腫瘍発症に必要である可能性を検討する目的で、EED cKOヘテロマウスにレトロウイルスによるretrovirus insertional mutagenesisを行った。その結果、EED cKOヘテロマウスはコントロールマウスに比べて短期間に高率に白血病を発症し、造血器腫瘍発症に対する感受性が亢進していることが明らかとなった。
さらに、我々はレトロウイルスを投与して白血病を発症した10匹のEED cKOヘテロマウスの腫瘍細胞について、Evi1（Ecotropic virus integration 1）遺伝子を共通ウイルス挿入部位として同定した。白血病細胞におけるEvi1の発現を検討したところ、多くの腫瘍で高発現しており、白血病発症に重要な役割を果たしていると考えられた。現在白血病発症におけるEEDヘテロ状態とEvi1高発現の協調作用を検討する目的で、コントロールマウスとEED cKOヘテロマウスから単離した造血前駆細胞にEvi1を導入して骨髄移植を行い、コントロールマウスに比べてEED cKOヘテロマウスで白血病発症の発症期間や頻度が変化するかどうかについて検討を行っている。
さらに、EEDヘテロがどの様な分子機構で白血病感受性を亢進させるかを解析する目的で、コントロールマウスおよびEED cKOヘテロマウスから造血幹細胞を単離し、RNAを抽出してトランスクリプトーム解析を行った。現在検体を提出中で、結果を待っている状態である。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

我々は、今年度の研究計画として、１）EED cKOヘテロマウスにおける造血器腫瘍発症の検討，２）EEDヘテロによる造血幹細胞における遺伝子発現変化の解析，３）EEDと直接結合する標的遺伝子の同定、の3項目を挙げた。
１）については、EED cKOヘテロマウスを用いて、EEDヘテロ状態は単独では造血器腫瘍発症には十分では無いが、2次的遺伝子異常と協調して白血病に関与することを見出した。さらに、白血病を発症したEED cKOヘテロマウスの腫瘍細胞を用いてiPCRを行い、ウイルス共通挿入遺伝子としてEvi1遺伝子同定した。さらに白血病細胞におけるEvi1の発現を検討したところ、多くの腫瘍で高発現しており、白血病発症に重要な役割を果たしていると考えられた。現在、骨髄移植の系を用いて、白血病発症におけるEEDヘテロ状態とEvi1高発現の協調作用の検討を行っている。
２）と３）については、コントロールマウスおよびEED cKOヘテロマウスから造血幹細胞を単離しRNAを抽出してトランスクリプトーム解析を行っている。昨年検体を提出したが、次世代シークエンサーの入れ替えなどがあり、まだ結果を受け取っていない。結果が判明次第、白血病関連遺伝子を選別し、定量PCRを用いて発現変化について確認すると共に、EED抗体およびヒストンH3K27me3抗体を用いてEEDの直接標的かどうかについて検討を行う予定である。

今後の研究の推進方策

１）EED cKOヘテロマウスにおける疾患発症が造血細胞自律的であることの検討：Eed cKOヘテロマウスは、2次的な遺伝子変化と協調して白血病発症に至ることが示された。これらのマウスにおいてEEDの発現低下は全身の細胞において生じているため、疾患発症の原因が造血細胞に由来することを示すためには、骨髄移植を用いて造血細胞のみに変異を誘導し、疾患が再現されるかどうかについて検討する必要がある。この目的で、Eed cKOヘテロマウスの造血幹細胞を用いて骨髄移植を行なう。コントロールマウスおよびEed cKOヘテロマウスから造血幹細胞を単離し、放射線照射した同系統のマウスに移植する。これらのマウスにおける末梢血のキメリズムを定期的に観察し、Eed cKOヘテロマウス由来の造血細胞がコントロールマウス造血細胞に比較して有意な細胞増殖能を示すことを確認する。

２）H3K27脱メチル化酵素であるJMJD3およびUTX cKOマウスの作製：H3K27のメチル化は、PRC2により正に制御（メチル化の方向に制御）されていると共に、H3K27特異的脱メチル化酵素であるJMJD3およびUTXにより負に制御（脱メチル化の方向に制御）されている。特に、UTXの機能欠失変異は造血器腫瘍を含めた様々なヒト悪性腫瘍において報告がなされており、H3K27メチル化による造血幹細胞の制御機構およびその逸脱による造血器腫瘍発症機構を明らかにするためには、これらの遺伝子操作マウスも作製し、H3K27メチル化の亢進および抑制の両面から解析を行なうことが必要と考えられる。この目的のため、我々はJMJD3およびUTXのcKOマウス作製の作製を行なう。手法としては、常法通り、機能ドメインをコードするエクソンをloxPで挟んだコンストラクトを作製し、相同組換えES細胞単離を行い、cKOマウスを作製し解析する。

研究成果

• [雑誌論文] Fbxl10 overexpression in murine hematopoietic stem cells induces leukemia involving metabolic activation and upregulation of Nsg2 (2015)
  • 著者名/発表者名: Ueda T, Nagamachi A, Takubo K, Yamasaki N, Matsui H, Kanai A, Nakata Y, Ikeda K, Konuma T, Oda H, Wolff L, Honda Z, WuX, Helin K, Iwama A, Suda T, Inaba T, Honda H
  • 雑誌名: Blood 巻: 125 ページ: 3437-3446
  • DOI: 10.1182/blood-2014-03-562694
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] Analysis of leukemogenic mechanisms by deregulated methylation of histone H3K27 (2014)
  • 著者名/発表者名: Honda H
  • 学会等名: The 73rd Annual Meeting of the Japanese Cancer Association
  • 発表場所: Tokyo
  • 年月日: 2014-09-27 – 2014-09-27
  • 招待講演
• [備考] 広島大学原爆放射線医科学研究所・疾患モデル解析研究分野HP
  • URL: http://home.hiroshima-u.ac.jp/sosai/top.html