関節リウマチにおける自然炎症の関与の解明

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 26293235
• 研究機関: 帝京大学
• 研究代表者: 河野 肇 帝京大学, 医学部, 准教授 (60585074)
• 研究分担者: 南木 敏宏 帝京大学, 医学部, 准教授 (00282749) ; 関根 知世子 帝京大学, 医学部, 助教 (40392005)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: インフラマソーム / 自然炎症 / NLRP3

研究実績の概要

[目的] 細胞死による炎症反応の分子機構、特にインフラマソーム形成の分子機構の解明。発現スクリーニングによりインフラマソーム活性化機構、もしくは抑制機構に関与する分子を同定する。
[方法] a) レトロウイルスライブラリー法　安定的にASC-Cerulean発現するマクロファージセルラインRAW264.7細胞を樹立した。この細胞は、LPS+ATPなどの刺激によりインフラマソーム活性化をきたし、細胞質に一様に存在してた分子が一ヶ所に集まりspeckleを形成する。 マクロファージより採取したmRNAを用いてレトロウイルスライブラリーを作成し、ASC-Cerulean発現RAW264.7細胞に感染させた後、インフラマソーム活性化刺激（LPSとATP刺激、もしくはLPS+死細胞の添加）を行う。インフラマソーム活性化は細胞死(パイロプトーシス)を導くため、刺激後に生存し、増殖してくる細胞を分離して、そこに発現しているレトロウイルスライブラリー由来の分子を同定することにより、インフラマソーム抑制性分子が同定される。またその逆に、リアルタイムでインフラマソーム活性化を観察できる利点を生かして、インフラマソーム活性化因子の同定を行う。b) 上皮細胞HEK293T細胞におけるインフラマソーム再構成法 リポフェクションによる遺伝子導入が容易であるHEK293T細胞に適量のASC-Cerulean発現する安定株を作成した。96wellプレートの1プレートあたり約4分で画像を取得できるハイスループットのアッセイ系となっている。ゲノムネットワークプロジェクト（GNP）で収集され、哺乳類発現ベクターにクローニングされたヒト完全長cDNAクローン(約13000クローン)を遺伝子導入することによりゲノムワイドのスクリーニングを行う。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

順調と評価する。
上皮細胞HEK293T細胞におけるインフラマソーム再構成法 リポフェクションによる遺伝子導入が容易であるHEK293T細胞に適量のASC-Cerulean発現する安定株を作成した。96wellプレートの1プレートあたり約4分で画像を取得できるハイスループットのアッセイ系となっている。この系において、陽性陰性コントロールが良好なシグナルノイズ比を持つこと、遺伝子導入が順調に行われることが確認された。

今後の研究の推進方策

当初の方針通りに進める。
ゲノムワイドライブラリーより発現ライブラリーを精製し、上皮細胞HEK293T細胞におけるインフラマソーム再構成法 において、陽性陰性遺伝子の単離を進める。

次年度使用額が生じた理由

試薬の購入が翌年となったため。

次年度使用額の使用計画

使用計画に変更無し。

研究成果

• [雑誌論文] Activation of an innate immune receptor, Nod1, accelerates atherogenesis in Apoe-/- mice (2015)
  • 著者名/発表者名: Kanno S, Nishio H, Tanaka T, Motomura Y, Murata K, Ihara K, Onimaru M, Yamasaki S, Kono H, Sueishi K, Hara T
  • 雑誌名: J Immunol 巻: 194 ページ: 773-780
  • DOI: 10.4049/jimmunol.1302841
  • 査読あり
• [雑誌論文] Inflammasome activation in response to dead cells and their metabolites (2014)
  • 著者名/発表者名: Kono H, Kimura Y, Latz E
  • 雑誌名: Curr Opin Immunol. 巻: 30 ページ: 91-98
  • DOI: 10.1016/j.coi.2014.09.001
  • 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Evaluation of the contribution of multiple DAMPs and DAMP receptors in cell death-induced sterile inflammatory responses (2014)
  • 著者名/発表者名: Kataoka H, Kono H, Patel Z, Kimura Y, Rock KL
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 9 ページ: e104741
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0104741
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Molecular determinants of sterile inflammation (2014)
  • 著者名/発表者名: Kono H, Onda A, Yanagida T
  • 雑誌名: Curr Opin Immunol 巻: 26 ページ: 147-156
  • DOI: 10.1016/j.coi.2013.12.004
  • 謝辞記載あり
• [雑誌論文] High-density lipoprotein mediates anti-inflammatory reprogramming of macrophages via the transcriptional regulator ATF3 (2014)
  • 著者名/発表者名: De Nardo D, Labzin LI, Kono H, Seki R, Schmidt SV, Beyer M, Xu D, Zimmer S, Lahrmann C, Schildberg FA, Vogelhuber J, Kraut M, Ulas T, Kerksiek A, Krebs W, Bode N, Grebe A, Fitzgerald ML, Hernandez NJ, Williams BR, Knolle P, Kneilling M, Röcken M, Lütjohann D, Wright SD, Schultze JL, Latz E
  • 雑誌名: Nat Immunol 巻: 15 ページ: 152-160
  • DOI: 10.1038/ni.2784
  • 査読あり / オープンアクセス