研究課題
難治性小児がんの新規治療標的を同定するために、次世代シークエンサー、高密度マイクロアレイといった革新的ゲノム解析技術を用いて、小児固形腫瘍の初発、転移、再発腫瘍のクローン進化を細胞レベルで経時的かつ網羅的に解析し、再発や転移を規定する分子病態の解明を試みる。本年度は、ALK変異を有する神経芽腫1例およびDICER1変異を有する甲状腺がん1例の凍結腫瘍検体を用いて、レーザーマイクロデイセクション(LMD)による単一細胞の単離とDNAの増幅を試みた。具体的には、凍結標本よりスタンプ標本を作製し、腫瘍細胞を単一層にスライドグラスに貼り付けら後に、LMDによる切り出しを行った。DNAの増幅には、全ゲノム増幅キットを用いた。増幅したDNAが腫瘍由来か否かを検討するために、それぞれの腫瘍でALK、DICER1の変異部位のサンガーシークエンスを行った。その結果、ALK変異は確認できなかったが、DICER1変異は確認できた。ALK変異が確認できなかった要因として、腫瘍細胞のintra-tumor heterogeneityの存在が示唆された。そこで、神経芽腫の腫瘍検体を用いて、deep sequencingを行い、ALK変異のアレル頻度を確認したところ、20%であった。従って、神経芽腫から分離する単一細胞数を増やして、更なる検証を行う予定である。また、神経芽腫2例における初発、再発腫瘍のエクソーム解析、deep sequencingを行い、クローン進化の評価を行った。その結果、再発腫瘍では、初発時のmajor cloneに新たな付加異常が加わったクローンが大半を占めており、これらの付加的な異常が悪性度を規定している可能性が示唆された。
2: おおむね順調に進展している
白血病細胞などの造血器腫瘍とは異なり、固形腫瘍における単一細胞は困難を極めているが、これまでの解析により神経芽腫と甲状腺がんからの単一細胞の単離、DNAの増幅には成功した。研究の第一段階は、達成した。また、次世代シークエンサーを用いたエクソーム解析、deep sequencingによりクローン進化の評価法も確立した。
単一細胞の単離、DNAの増幅には成功したものの、検体によっては、不安定な部分もあり、更なる条件検討が必要である。そこで、さらに症例を増やして、単一細胞の単離を試みる。さまざまなコンディションの腫瘍検体を解析することにより、安定した手法の確立を目指す。また、抽出したDNAを用いたSNPアレイも行って、ゲノムコピー数の網羅的解析が可能か否かの検証を行う。条件検討により手法を確立し、多数検体の解析が可能なシステムを構築する。また、単一細胞シークエンスと平行して、初発、転移巣、再発腫瘍のゲノムワイドな解析を行い、腫瘍細胞のもつクローンの集団進化の検討も進める。また腫瘍内のintra-tumor heterogeneityを解明するために、同一腫瘍の複数個所を切り出して、エクソーム解析、SNPアレイ解析、deep sequencingを行う。解析腫瘍としては、神経芽腫、肝芽腫、膵芽腫を予定している。
年度末旅費が見積りより少なかったため、少額の未使用金が生じた
27年度購入の消耗品の一部にあてる予定
すべて 2015 2014
すべて 雑誌論文 (24件) (うち査読あり 24件、 オープンアクセス 24件、 謝辞記載あり 5件) 学会発表 (53件) (うち招待講演 3件)
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