| 研究課題/領域番号 |
26293259
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
久保 亮治 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (70335256)
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| 研究分担者 |
佐々木 貴史 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (70306843)
天谷 雅行 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (90212563)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | タイトジャンクション / 皮膚バリア / 表皮角化 / 重層上皮細胞 / 単層上皮細胞 |
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| 研究実績の概要 |
１．表皮タイトジャンクション（TJ）バリアの恒常性維持機構の解析
表皮細胞は、分化して基底層を離れた後、有棘層、顆粒層を経て角化脱核して角質層を形成する。この分化期間の間に、表皮細胞は顆粒層のSG2層において、ただ1回のみTJを形成する。顆粒層において表皮細胞は、細胞膜極性を持たずTJを持たないSG3細胞から、細胞膜極性を示しTJバリアを持つSG2細胞、さらに細胞膜極性とTJを失ったSG1細胞へと分化する。この分化過程におけるTJバリアの挙動を観察するために、ZO-1-Venus融合蛋白質を顆粒層特異的に発現するマウスの耳皮膚を、二光子顕微鏡を用いて３次元タイムラプス観察を行い、固定標本の詳細な３次元観察と対応させることにより、TJバリアのターンオーバー機構を解析した。単層上皮では、脱落する細胞のまわりを多数の細胞が取り囲んで押し上げ、その細胞の周囲の環状のTJを縮小させていき、最終的にまわりの細胞同士で新たなTJバリアを形成し、古い細胞を排除・脱落させることによりTJバリアの恒常性を保つ。今年度、我々は、まるで潜水艦のハッチや宇宙船のエアロックのように、内側の扉が閉じてから（内側に新しいTJが作られてから）外側の扉が開く（外側のTJが失われる）、これまで想定されていなかった全く新しい恒常性維持機構が角化重層上皮には存在することを見出した。
２．顆粒層の各分化段階特異的な細胞の単離方法の確立
ETAの皮下注によりTJバリアの内側でのみデスモソームを消化するとともに蛋白ビオチン化試薬を皮下注することにより、SG2細胞のみがビオチンラベルされた、SG1/SG2細胞からなるETAシートを得た。ここからSG1、SG2それぞれの細胞を特異的に高純度で単離し、マイクロアレイ法を用いた遺伝子発現解析を行い、SG1/SG2に特異的に発現する複数の新規バリア関連候補蛋白を得た。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
１．表皮タイトジャンクション（TJ）バリアの恒常性維持機構の解析
平成２６年度の目標としていた、１）ZO-1-Venus融合蛋白質を顆粒層特異的に発現するマウスの耳皮膚を用いた３次元タイムラプス観察による表皮TJバリアのターンオーバーのin vivoイメージング、２）３次元観察における細胞間浸透の可視化による、SG細胞層のターンオーバー過程とリンクさせたTJバリア機能解析方法の確立、を行った。これらの新しい観察手段により、重層上皮シートにおけるTJバリアのターンオーバー過程を詳細に観察することが可能となった。
２．顆粒層の各分化段階特異的な細胞の単離方法の確立
マウス皮膚表皮よりSG1、SG2それぞれの細胞を特異的に高純度で単離する方法を確立した。本手法を確立したことで、SG1、SG2それぞれの細胞からマイクロアレイ法を用いた遺伝子発現解析を行い、時期特異的に発現上昇する遺伝子を特定することが可能となった。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．表皮タイトジャンクション（TJ）バリアの恒常性維持機構の解析
SG層細胞のターンオーバー時に一過性に出現する、２重のTJを形成するための分子メカニズムの解析を行う。特に、隣り合う３つの細胞の隙間をシールするために必須の構造であるトリセルラーTJの構成蛋白の挙動に着目して解析を進める。単層上皮シートではxy平面上の隣り合う３つの細胞の角にのみトリセルラーTJが形成されるが、重層上皮シートでは上下に積み重なった３つの細胞の接着面にトリセルラーTJ様構造が、分化過程の途中で一過性に出現することを発見しており、このトリセルラーTJ様構造が、ターンオーバー時に出現する２重のTJの形成に関わっている可能性を追求する。
２．顆粒層の各分化段階特異的な遺伝子発現の解析
SG1細胞で高発現を示す遺伝子（特に抗菌ペプチド関連因子、酸化ストレス応答因子、細胞接着の調節に重要な蛋白リン酸化酵素）に着目して、局在解析と様々なストレス下での発現変化の解析を行い、角層ストレスに応答して発現上昇する遺伝子候補を検索する。また、ヒト皮膚を用いても同様の実験を行い、SG1細胞で高発現を示し、ストレス応答が亢進している状態の疾患皮膚（乾癬など）で発現上昇を示す遺伝子を検索する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
Z軸方向の解像度に優れたN-SIM超解像顕微鏡（ZEISS）を時間単位のレンタル料金を支払いつつ使用して、表皮シートの３次元観察において細胞間への物質浸透の可視化に挑戦し、２重のTJが形成されたときのSG2-SG3細胞間への物質浸透の有無（内側のTJのバリア機能の有無）を解析する予定であった。しかしN-SIM顕微鏡を用いるかわりに、サンプル側を表皮全層シートでなくETAシート（ブドウ球菌毒素により処理した角質層とSG1, SG2細胞からなるシート）を用いる工夫をすることによって、２重のTJにおける浸透実験を通常のコンフォーカル顕微鏡を用いて行うことに成功した。そのため、N-SIMS顕微鏡のレンタル料金として計上していた予算を今年度は使用せずに、来年度以降に使用することとした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
顆粒層細胞の各分化段階（TJを持たないSG3細胞から、TJを持つSG2細胞、そして再びTJを失うSG1細胞、最終角化）をより詳細に観察するために、N-SIM顕微鏡を用いた高精細観察を行う。特に、顆粒層の各分化段階特異的な遺伝子発現の解析計画により得られた候補蛋白の局在解析を高解像度で行うことにより、従来のコンフォーカル顕微鏡による観察では得られなかった知見が得られることが期待される。
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